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Che cosa è l'elettroforesi del gel di poliacrilammide (PAGINA)?

Le tecniche elettroforetiche separano le molecole fatte pagare in un campo elettrico. La mobilità di una molecola è inversamente proporzionale alla sua dimensione e direttamente proporzionale alla sua tassa. Durante l'elettroforesi, le proteine avanzano verso un elettrodo in modo opposto fatto pagare in un campo elettrico.

La tariffa del loro movimento in un sistema elettroforetico è governata da parecchi fattori quali la temperatura, il pH e la concentrazione nel buffer oltre ai beni intrinsechi quali la dimensione, la tassa e la forma delle proteine.

La separazione elettroforetica di proteine in base al loro peso molecolare è rigorosamente possibile soltanto se la tassa di tutte le molecole di proteina può essere manipolata allo stesso segno. In tal caso, la mobilità delle molecole di proteina sarà solamente fiduciosa nella loro dimensione.

L'elettroforesi del gel di poliacrilammide (PAGINA) è una tecnica basata su questa idea ed è usata per separare le proteine in base alla loro dimensione.

Principi di PAGINA

In PAGINA, un detersivo anionico chiamato solfato dodecilico di sodio (SDS) è usato per legare alle proteine e per dare loro una carica negativa. Le proteine poi sono separate elettroforeticamente secondo la loro dimensione facendo uso di una matrice del gel fatta del poliacrilammide in un campo elettrico.

Il poliacrilammide è prodotto come conseguenza della reazione di polimerizzazione fra l'acrilamide e N, N'-metilene-Banca dei Regolamenti Internazionali-acrilamide (Banca dei Regolamenti Internazionali) facendo uso di un catalizzatore. Il grado di polimerizzazione o di inter-collegamento può essere gestito regolando la concentrazione di acrilamide e di Banca dei Regolamenti Internazionali.

Più il inter-collegamento più duro il gel. La durezza del gel, a sua volta, modula l'attrito sperimentato dalle macromolecole quando attraversano through il gel durante la PAGINA, così pregiudicanti la risoluzione della separazione.

I gel sciolti (acrilamide 4-8%) permettono le più alte molecole del peso molecolare migrino più velocemente attraverso il gel mentre i gel duri (acrilamide 12-20%) limitano la migrazione di grandi molecole e selettivamente permettono che quelle piccole si muovano attraverso il gel.

gel di caricamento di elettroforesi

Protocollo di SDS-PAGE

1. Preparato del campione:

I campioni della proteina sono denaturati riscaldandoli con un detersivo SDS e un mercaptoetanolo. Le precedenti legature forte alle proteine e dà loro un'alta carica negativa mentre l'ultimo libera i gruppi solfidrilici, così rendere il polipeptide incatena il trasporto una carica negativa in eccesso e di simile tassa al rapporto di massa. Ciò aiuta la risoluzione delle proteine basate rigorosamente sulla loro dimensione durante l'elettroforesi del gel.

2. Preparato del gel:

Il gel elettroforetico ha solitamente parecchie componenti compreso l'acrilamide, la Banca dei Regolamenti Internazionali e un buffer. La miscela è degassata per impedire la formazione della bolla durante la polimerizzazione del gel. Il persolfato dell'ammonio, una sorgente del radicale libero e uno stabilizzatore si aggiungono a polimerizzazione di inizio. La Banca dei Regolamenti Internazionali egualmente si aggiunge ai legami incrociati del modulo fra le molecole dell'acrilamide fino a formare un gel infine.

3. Elettroforesi:

Mentre una corrente elettrica è applicata le proteine migrano attraverso il gel all'elettrodo positivo poichè hanno una carica negativa. Ogni molecola si muove ad una tariffa differente basata più rapido sul suo peso molecolare - piccolo movimento delle molecole attraverso il gel che quei più grandi. La migrazione è solitamente più veloce alle più alte tensioni. Dopo alcune ore, le molecole di proteina tutte sono separate dalla dimensione.

4. Macchiatura e visualizzazione:

Una volta che l'elettroforesi è completa, il gel può essere macchiato facendo uso delle tinture colorate quali il blu di Coomassie o il bromuro di etidio brillante per fare le proteine separate comparire come bande colorate distinte sul gel.

La tintura non legata è scolorita dal gel. I gel macchiati poi sono asciugati in modo dall'intensità del colore delle bande della proteina può essere misurata. Le bande delle proteine radioattive possono essere individuate da autoradiografia. Le proteine possono anche essere quantificate come il contenuto proteico è direttamente proporzionali alla quantità della tintura rilegata.

Alcuni sistemi del gel presentano una tintura tenente la carreggiata quale il blu del bromofenolo con il campione della proteina - la distanza visibile ha viaggiato dalla tintura sulle guide del gel nella decisione della durata richiesta dell'elettroforesi. Il blu del bromofenolo viaggia con le molecole del campione finché finalmente non raggiunga il fondo del gel. L'elettroforesi deve smettere a questo punto di non assicurare molecole di proteina electrophorese dal gel e nel buffer.

Elettroforesi del gel

Riferimenti:

  1. http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/sdspage/sdspage.html#PAGE
  2. http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf
  3. https://www.thermofisher.com/ca/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-electrophoresis.html
  4. https://www.udel.edu/biology/fschmieg/411acrylamide.htm

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Last Updated: Jun 28, 2019

Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

Citations

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    Cheriyedath, Susha. (2019, June 28). Che cosa è l'elettroforesi del gel di poliacrilammide (PAGINA)?. News-Medical. Retrieved on March 06, 2021 from https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Polyacrylamide-Gel-Electrophoresis-(PAGE).aspx.

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