As técnicas Electrophoretic separam moléculas cobradas em um campo elétrico. A mobilidade de uma molécula é inversamente proporcional a seu tamanho e directamente proporcional a sua carga. Durante a electroforese, as proteínas movem-se para um eléctrodo oposta cobrado em um campo elétrico.
A taxa de seu movimento em um sistema electrophoretic é governada por diversos factores tais como a temperatura, o pH, e a concentração do amortecedor além do que propriedades intrínsecas tais como o tamanho, a carga e a forma das proteínas.
A separação Electrophoretic de proteínas restrita com base em seu peso molecular é possível somente se a carga de todas as moléculas de proteína pode ser manipulada ao mesmo sinal. Em tal caso, a mobilidade das moléculas de proteína será unicamente dependente em seu tamanho.
A electroforese do gel de Polyacrylamide (PÁGINA) é uma técnica baseada nesta ideia e é usada para separar proteínas com base em seu tamanho.
Princípios de PÁGINA
Na PÁGINA, um detergente aniónico chamado sulfato dodecyl de sódio (SDS) é usado para ligar às proteínas e para dar-lhes uma carga negativa. As proteínas são separadas então electrophoretically de acordo com seu tamanho usando uma matriz do gel feita do polyacrylamide em um campo elétrico.
O Polyacrylamide é produzido em conseqüência da reacção da polimerização entre o acrilamido e o N, N'-metileno-bis-acrilamido (BIS) que usa um catalizador. O grau de polimerização ou de cruz-ligamento pode ser controlado ajustando a concentração de acrilamido e de BIS.
Mais o cruz-ligamento do mais duro o gel. A dureza do gel, por sua vez, modula a fricção experimentada pelas macromoléculas quando viajam através do gel durante a PÁGINA, assim afetando a definição da separação.
Os geles fracos (acrilamido 4-8%) permitem umas moléculas mais altas do peso molecular migrem mais rapidamente através do gel quando os geles duros (acrilamido 12-20%) restringirem a migração de grandes moléculas e selectivamente permitirem que as pequenas movam-se através do gel.
Protocolo de SDS-PAGE
1. Preparação da amostra:
As amostras da proteína são desnaturadas aquecendo os com um detergente SDS e mercaptoethanol. Os ligamentos anteriores fortemente às proteínas e dão-lhes uma carga negativa alta enquanto o último livra grupos do sulfhydryl, assim render o polipeptídeo acorrenta levar uma carga negativa adicional e a carga similar à relação em massa. Isto ajuda a definição das proteínas baseadas restrita em seu tamanho durante a electroforese do gel.
2. Preparação do gel:
O gel electrophoretic tem geralmente diversos componentes incluir o acrilamido, o BIS, e um amortecedor. A mistura é desgaseificada para impedir a formação da bolha durante a polimerização do gel. O persulfate do amónio, uma fonte do radical livre, e um estabilizador são adicionados à polimerização do começo. O BIS está adicionado igualmente às ligações transversais do formulário entre moléculas do acrilamido até que um gel esteja formado finalmente.
3. Electroforese:
Enquanto uma corrente elétrica é aplicada as proteínas migram através do gel ao eléctrodo positivo porque têm uma carga negativa. Cada molécula move-se em uma taxa diferente baseada em seu peso molecular - movimento pequeno das moléculas mais ràpida através do gel do que os maiores. A migração é geralmente mais rápida em umas mais altas tensões. Após algumas horas, todas as moléculas de proteína são separadas pelo tamanho.
4. Mancha e visualização:
Uma vez que a electroforese está completa, o gel pode ser manchado usando tinturas coloridas tais como o azul de Coomassie ou o brometo de ethidium brilhante para fazer as proteínas separadas aparecer como faixas coloridas distintas no gel.
A tintura desatada é lavada para fora do gel. Os geles manchados são secados então assim que a intensidade da cor das faixas da proteína pode ser medida. As faixas de proteínas radioactivas podem ser detectadas pela autoradiografia. As proteínas podem igualmente ser determinadas como o índice de proteína são directamente proporcionais à quantidade da tintura encadernada.
Alguns sistemas do gel introduzem uma tintura de seguimento tal como o azul do bromofenol junto com a amostra da proteína - a distância visível viajou pela tintura nas ajudas do gel em decidir a duração exigida da electroforese. O azul do bromofenol viaja junto com as moléculas da amostra até que alcance eventualmente a parte inferior do gel. A electroforese precisa de parar neste momento para não assegurar nenhuma molécula de proteína electrophorese fora do gel e no amortecedor.
Referências:
- http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/sdspage/sdspage.html#PAGE
- http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf
- https://www.thermofisher.com/ca/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-electrophoresis.html
- https://www.udel.edu/biology/fschmieg/411acrylamide.htm
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