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Que é electroforese do gel de Polyacrylamide (PÁGINA)?

As técnicas Electrophoretic separam moléculas cobradas em um campo elétrico. A mobilidade de uma molécula é inversamente proporcional a seu tamanho e directamente proporcional a sua carga. Durante a electroforese, as proteínas movem-se para um eléctrodo oposta cobrado em um campo elétrico.

A taxa de seu movimento em um sistema electrophoretic é governada por diversos factores tais como a temperatura, o pH, e a concentração do amortecedor além do que propriedades intrínsecas tais como o tamanho, a carga e a forma das proteínas.

A separação Electrophoretic de proteínas restrita com base em seu peso molecular é possível somente se a carga de todas as moléculas de proteína pode ser manipulada ao mesmo sinal. Em tal caso, a mobilidade das moléculas de proteína será unicamente dependente em seu tamanho.

A electroforese do gel de Polyacrylamide (PÁGINA) é uma técnica baseada nesta ideia e é usada para separar proteínas com base em seu tamanho.

Princípios de PÁGINA

Na PÁGINA, um detergente aniónico chamado sulfato dodecyl de sódio (SDS) é usado para ligar às proteínas e para dar-lhes uma carga negativa. As proteínas são separadas então electrophoretically de acordo com seu tamanho usando uma matriz do gel feita do polyacrylamide em um campo elétrico.

O Polyacrylamide é produzido em conseqüência da reacção da polimerização entre o acrilamido e o N, N'-metileno-bis-acrilamido (BIS) que usa um catalizador. O grau de polimerização ou de cruz-ligamento pode ser controlado ajustando a concentração de acrilamido e de BIS.

Mais o cruz-ligamento do mais duro o gel. A dureza do gel, por sua vez, modula a fricção experimentada pelas macromoléculas quando viajam através do gel durante a PÁGINA, assim afetando a definição da separação.

Os geles fracos (acrilamido 4-8%) permitem umas moléculas mais altas do peso molecular migrem mais rapidamente através do gel quando os geles duros (acrilamido 12-20%) restringirem a migração de grandes moléculas e selectivamente permitirem que as pequenas movam-se através do gel.

geles da carga da electroforese

Protocolo de SDS-PAGE

1. Preparação da amostra:

As amostras da proteína são desnaturadas aquecendo os com um detergente SDS e mercaptoethanol. Os ligamentos anteriores fortemente às proteínas e dão-lhes uma carga negativa alta enquanto o último livra grupos do sulfhydryl, assim render o polipeptídeo acorrenta levar uma carga negativa adicional e a carga similar à relação em massa. Isto ajuda a definição das proteínas baseadas restrita em seu tamanho durante a electroforese do gel.

2. Preparação do gel:

O gel electrophoretic tem geralmente diversos componentes incluir o acrilamido, o BIS, e um amortecedor. A mistura é desgaseificada para impedir a formação da bolha durante a polimerização do gel. O persulfate do amónio, uma fonte do radical livre, e um estabilizador são adicionados à polimerização do começo. O BIS está adicionado igualmente às ligações transversais do formulário entre moléculas do acrilamido até que um gel esteja formado finalmente.

3. Electroforese:

Enquanto uma corrente elétrica é aplicada as proteínas migram através do gel ao eléctrodo positivo porque têm uma carga negativa. Cada molécula move-se em uma taxa diferente baseada em seu peso molecular - movimento pequeno das moléculas mais ràpida através do gel do que os maiores. A migração é geralmente mais rápida em umas mais altas tensões. Após algumas horas, todas as moléculas de proteína são separadas pelo tamanho.

4. Mancha e visualização:

Uma vez que a electroforese está completa, o gel pode ser manchado usando tinturas coloridas tais como o azul de Coomassie ou o brometo de ethidium brilhante para fazer as proteínas separadas aparecer como faixas coloridas distintas no gel.

A tintura desatada é lavada para fora do gel. Os geles manchados são secados então assim que a intensidade da cor das faixas da proteína pode ser medida. As faixas de proteínas radioactivas podem ser detectadas pela autoradiografia. As proteínas podem igualmente ser determinadas como o índice de proteína são directamente proporcionais à quantidade da tintura encadernada.

Alguns sistemas do gel introduzem uma tintura de seguimento tal como o azul do bromofenol junto com a amostra da proteína - a distância visível viajou pela tintura nas ajudas do gel em decidir a duração exigida da electroforese. O azul do bromofenol viaja junto com as moléculas da amostra até que alcance eventualmente a parte inferior do gel. A electroforese precisa de parar neste momento para não assegurar nenhuma molécula de proteína electrophorese fora do gel e no amortecedor.

Electroforese do gel

Referências:

  1. http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/sdspage/sdspage.html#PAGE
  2. http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf
  3. https://www.thermofisher.com/ca/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-electrophoresis.html
  4. https://www.udel.edu/biology/fschmieg/411acrylamide.htm

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Last Updated: Jun 28, 2019

Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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