Las técnicas electroforéticas separan las moléculas cargadas en un campo eléctrico. La movilidad de una molécula es inverso proporcional a su talla y directamente proporcional a su carga. Durante electroforesis, las proteínas se mueven hacia un electrodo opuesto cargado en un campo eléctrico.
El índice de su movimiento en un sistema electroforético es regulado por varios factores tales como temperatura, pH, y concentración del almacenador intermedio además de propiedades intrínsecas tales como la talla, la carga y la forma de las proteínas.
La separación electroforética de proteínas en base de su peso molecular es estrictamente posible solamente si la carga de todas las moléculas de proteína se puede manipular al mismo signo. En tal caso, la movilidad de las moléculas de proteína será solamente confiada en su talla.
La electroforesis del gel de poliacrilamida (PAGINACIÓN) es una técnica basada en esta idea y se utiliza para separar las proteínas en base de su talla.
Principios de la PAGINACIÓN
En la PAGINACIÓN, un detersorio aniónico llamado sulfato dodecyl de sodio (SDS) se utiliza para atar a las proteínas y para darles una carga negativa. Las proteínas entonces se separan electroforético según su talla usando una matriz del gel hecha de la poliacrilamida en un campo eléctrico.
La poliacrilamida se produce como resultado de la reacción de la polimerización entre la acrilamida y N, N'-metileno-bis-acrilamida (BIS) usando un catalizador. El grado de polimerización o de interconexión puede ser controlado ajustando la concentración de acrilamida y de BIS.
Más es la interconexión más duro es el gel. El endurecimiento del gel, a su vez, modula la fricción experimentada por las macromoléculas cuando viajan a través del gel durante la PAGINACIÓN, así afectando a la resolución de la separación.
Los geles flojos (acrilamida 4-8%) permiten moléculas más altas del peso molecular emigren más rápidamente a través del gel mientras que los geles duros (acrilamida 12-20%) restringen la migración de moléculas grandes y selectivamente permiten que las pequeñas se muevan a través del gel.
Protocolo de SDS-PAGE
1. Preparación de la muestra:
Las muestras de la proteína son desnaturalizadas calentándolos con un detersorio SDS y mercaptoetanol. Los lazos anteriores fuertemente a las proteínas y les dan una alta carga negativa mientras que este último libera grupos del sulfidrilo, así el rendimiento del polipéptido encadena llevar exceso de una carga negativa y la carga similar a la índice en masa. Esto ayuda a la resolución de las proteínas basadas estrictamente en su talla durante electroforesis del gel.
2. Preparación del gel:
El gel electroforético tiene generalmente varios componentes incluyendo la acrilamida, el BIS, y un almacenador intermedio. La mezcla se desgasifica para prevenir la formación de la burbuja durante la polimerización del gel. El persulfato del amonio, una fuente del radical libre, y un estabilizador se agregan a la polimerización del comienzo. El BIS también se agrega a las interconexiones de la forma entre las moléculas de la acrilamida hasta que un gel se forme final.
3. Electroforesis:
Mientras que una corriente eléctrica es aplicada las proteínas emigran a través del gel al electrodo positivo pues tienen una carga negativa. Cada molécula se mueve a un diverso régimen basado en su peso molecular - pequeño movimiento de las moléculas más rápidamente a través del gel que los más grandes. La migración es generalmente más rápida en voltajes más altos. Después de algunas horas, las moléculas de proteína todas son separadas por talla.
4. Coloración y visualización:
Una vez que la electroforesis es completa, el gel se puede manchar usando los tintes coloreados tales como azul de Coomassie o bromuro de etidio brillante para hacer que las proteínas separadas aparecen como bandas coloreadas distintas en el gel.
El tinte desatado se elimina del gel. Los geles manchados entonces se secan así que la intensidad del color de las bandas de la proteína puede ser medida. Las bandas de proteínas radioactivas se pueden descubrir por la autoradiografía. Las proteínas se pueden también cuantificar como el contenido proteínico son directamente proporcionales a la cantidad del tinte encuadernado.
Algunos sistemas del gel introducen un tinte de búsqueda tal como azul del bromofenol junto con la muestra de la proteína - la distancia visible viajó por el tinte en las ayudas del gel en decidir a la duración requerida de la electroforesis. El azul del bromofenol viaja junto con las moléculas de la muestra hasta que alcance eventual la parte inferior del gel. La electroforesis necesita parar a este punto para no asegurar ninguna molécula de proteína electrophorese fuera del gel y en el almacenador intermedio.
Referencias:
- http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/sdspage/sdspage.html#PAGE
- http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf
- https://www.thermofisher.com/ca/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-electrophoresis.html
- https://www.udel.edu/biology/fschmieg/411acrylamide.htm
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