Pyrosequencing est une méthode d'ordonnancement d'ADN qui trouve la lumière émise pendant l'ajout séquentiel des nucléotides pendant la synthèse d'un brin d'ADN complémentaire.
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Pyrosequencing peut être employé pour trouver l'ADN et l'ARN de presque n'importe quelle source, et a des applications dans l'examen critique de résistance de bactéries, le développement de médicament, l'epigenetics, et beaucoup d'autres domaines.
Procédé de Pyrosequencing
Pyrosequencing se produit dans six opérations importantes :
- L'ADN qui doit être ordonnancé est cassé dans des éclats d'environ 100 paires de bases d'ADN à un fil.
- Une amplification en chaîne par polymérase (PCR) est faite fonctionner de produire des millions de copies identiques de chaque fragment d'ADN, qui sont divisées en travers des milliers de puits, avec juste un type de fragment d'ADN selon le puits.
- Les fragments d'ADN sont incubés avec de l'ADN polymérase, l'ATP-SULFURYLASE, et les enzymes d'apyrase, et l'adénosine 5' des substrats de phosphosulfate et de luciferin.
- Un des quatre types de nucléotides qui composent l'ADN sont ajoutés aux puits, qui commencent à être comportés sur la matrice à un fil d'ADN par l'ADN polymérase au 3' extrémité, relâchant l'ATP-SULFURYLASE de pyrophosphate puis convertissent le pyrophosphate en adénosine triphosphate (ATP) en présence de l'adénosine 5' phosphosulfate. L'ATP participe alors à la conversion luciferase-assistée du luciferin en oxyluciferin. Ce procédé émet la lumière proportionnellement à la quantité d'ATP participant à la conversion, qui est captée par un détecteur.
- Les nucléotides inutilisés et l'ATP dégradent à l'apyrase, permettant à la réaction de reprendre par de l'autre nucléotide. Ce procédé est répété, ajoutant chaque nucléotide l'un après l'autre jusqu'à ce que la synthèse soit complète.
- Un détecteur capte l'intensité de la lumière émise par le procédé, qui est alors employé pour impliquer le nombre et le type de nucléotides ajoutés. Par exemple, si trois nucléotides de cytosine sont ajoutés séquentiellement au même fragment d'ADN, la lumière émise sera trois fois plus forte que des fragments d'ADN avec seulement un nucléotide de cytosine ajouté.
Si aucune lumière n'est émise sur l'ajout de la cytosine, alors la prochaine base élogieuse dans la matrice à un fil d'ADN doit être l'un les trois des autres nucléotides.
Il convient noter que des quatre nucléotides ajoutés pendant pyrosequencing, le triphosphate de déoxyadénosine (a) est remplacé par le triphosphate α-thio de déoxyadénosine pour éviter un faux signal de la réaction tôt au luciferase.
La méthode est limitée à environ 300-500 paires de bases de nucléotide, avec les portées plus grandes de plus de 1000 paires de bases réalisables utilisant l'ordonnancement de Sanger. Elle est, cependant, moins chère et disponible dans le commerce.
Applications de pyrosequencing
Pyrosequencing
Pyrosequencing est employé pour indiquer code génétique d'une partie d'ADN. Il peut également trouver des polymorphismes uniques de nucléotide, mise en place-omissions ou d'autres variations de séquence, en plus de pouvoir mesurer la méthylation et la fréquence de l'allèle d'ADN.
Par exemple, des régions de génome liées à une affection génétique peuvent être rétrécies vers le bas davantage pour recenser les gènes spécifiques et les variations dans eux, ou une réaction négative héritée à certains médicaments peut être vérifiée avant que le médicament soit prescrit.
La méthode de résistance au médicament dans une souche de bactéries neuve peut être déterminée par son altération génétique comparée à un ancêtre, ou la méthylation de l'ADN épigénétique dans une cellule cancéreuse peut être trouvée afin de déterminer le meilleur traitement.
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