Pyrosequencing è un metodo di ordinamento del DNA che individua l'indicatore luminoso emesso durante l'aggiunta sequenziale dei nucleotidi durante la sintesi di un filo complementare di DNA.
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Pyrosequencing può essere usato per individuare il DNA ed il RNA da quasi tutta la sorgente ed ha applicazioni nella selezione della resistenza dei batteri, nello sviluppo della droga, in epigenetics ed in molti altri campi.
Trattamento di Pyrosequencing
Pyrosequencing si presenta a sei punti importanti:
- Il DNA che deve essere ordinato è rotto su nei frammenti di intorno 100 coppie di basi del DNA del unico filo.
- Una reazione a catena della polimerasi (PCR) è funzionata per creare milioni di copie identiche di ogni sequenza di DNA, che sono spaccate attraverso migliaia di pozzi, con appena un tipo di sequenza di DNA per pozzo.
- Le sequenze di DNA sono incubate con la DNA polimerasi, ATP-SOLFORILASI ed enzimi di apyrase ed adenosina 5' substrati di luciferin e del phosphosulfate.
- Uno dei quattro tipi di nucleotidi che compongono il DNA si aggiunge ai pozzi, che cominciano ad essere incorporati sul modello del DNA del unico filo dalla DNA polimerasi al 3' estremità, rilascianti l'ATP-SOLFORILASI del pirofosfato quindi converte il pirofosfato in adenosintrifosfato (ATP) in presenza di adenosina 5' phosphosulfate. Il trifosfato di adenosina poi partecipa alla conversione luciferase-mediata del luciferin al oxyluciferin. Questo trattamento emette l'indicatore luminoso proporzionalmente alla quantità di trifosfato di adenosina che partecipa alla conversione, che è presa da un rivelatore.
- I nucleotidi ed il trifosfato di adenosina inutilizzati si degradano al apyrase, permettendo che la reazione cominci ancora con un altro nucleotide. Questo trattamento è ripetuto, aggiungente ogni nucleotide uno dopo l'altro finché la sintesi non sia completa.
- Un rivelatore prende l'intensità di indicatore luminoso emessa tramite il trattamento, che poi è usato per arguire il numero ed il tipo di nucleotidi aggiunti. Per esempio, se tre nucleotidi della citosina si aggiungono in sequenza allo stesso frammento di DNA, l'indicatore luminoso emesso sarà tre volte più intenso dei frammenti di DNA con soltanto un nucleotide della citosina aggiunto.
Se nessun indicatore luminoso è emesso sopra l'aggiunta di citosina, quindi la base gratuita seguente sul modello del DNA del unico filo deve essere uno degli altri tre nucleotidi.
Dovrebbe essere notato che dei quattro nucleotidi aggiunti durante pyrosequencing, il trifosfato della deossiadenosina (A) è sostituito con il trifosfato α-tio della deossiadenosina per evitare un segnale falso dalla reazione iniziale con il luciferase.
Il metodo è limitato ad intorno 300-500 coppie di basi del nucleotide, rispetto alle maggiori lunghezze a catena oltre di 1000 coppie di basi realizzabili facendo uso dell'ordinamento di Sanger. È, tuttavia, meno costoso e disponibile nel commercio.
Applicazioni di pyrosequencing
Pyrosequencing
Pyrosequencing è usato per rivelare il codice genetico di una sezione di DNA. Può egualmente da individuare i singoli polimorfismi del nucleotide, inserzione-eliminazioni o altre variazioni di sequenza, oltre a potere da quantificare la metilazione e la frequenza allelica del DNA.
Per esempio, le regioni del genoma connesse con una malattia genetica possono essere restrette più ulteriormente per identificare i geni specifici e le variazioni loro, o una risposta negativa ereditata a determinate droghe può essere controllata prima che il medicinale sia prescritto.
Il metodo di farmacoresistenza in un nuovo sforzo dei batteri può essere determinato dal suo cambiamento genetico confrontato ad un antenato, o la metilazione epigenetica di DNA in una cellula tumorale può essere individuata per determinare il migliore corso del trattamento.
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