Pyrosequencing é um método de arranjar em seqüência do ADN que detecta a luz emissora durante a adição seqüencial de nucleotides durante a síntese de uma costa complementar do ADN.
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Pyrosequencing pode ser usado para detectar o ADN e o RNA de quase toda a fonte, e tem aplicações na selecção da resistência das bactérias, na revelação da droga, no epigenetics, e nos muitos outros campos.
Processo de Pyrosequencing
Pyrosequencing ocorre em seis etapas principais:
- O ADN que deve ser arranjado em seqüência é quebrado acima em fragmentos de ao redor 100 pares baixos de ADN da único-costa.
- Uma reacção em cadeia da polimerase (PCR) é executada criar milhões de cópias idênticas de cada fragmento do ADN, que são separação através dos milhares de poços, com o apenas um tipo de fragmento do ADN pelo poço.
- Os fragmentos do ADN são incubados com polimerase de ADN, ATP-SULFURILASE, e enzimas do apyrase, e adenosina 5' carcaças do phosphosulfate e do luciferin.
- Um dos quatro tipos de nucleotides que compo o ADN é adicionado aos poços, que começam a ser incorporados no molde do ADN da único-costa pela polimerase de ADN no 3' extremidade, liberando a ATP-SULFURILASE do pirofosfato a seguir converte o pirofosfato ao triphosphate de adenosina (ATP) na presença da adenosina 5' phosphosulfate. O ATP participa então na conversão luciferase-negociada do luciferin ao oxyluciferin. Este processo emite-se a luz proporcionalmente à quantidade de ATP que participa na conversão, que é pegarada por um detector.
- Os nucleotides e o ATP não utilizados degradam ao apyrase, permitindo que a reacção comece outra vez com um outro nucleotide. Este processo está repetido, adicionando cada nucleotide em sucessão até que a síntese esteja completa.
- Um detector pegara a intensidade da luz emissora pelo processo, que é usado então para pressupr o número e o tipo de nucleotides adicionados. Por exemplo, se três nucleotides do cytosine são adicionados sequencialmente ao mesmo fragmento do ADN, a luz emissora será três vezes mais intensa do que fragmentos do ADN com o somente um nucleotide do cytosine adicionado.
Se nenhuma luz é emitida em cima da adição de cytosine, a seguir a base elogiosa seguinte no molde do ADN da único-costa deve ser um de outros três nucleotides.
Deve-se notar que dos quatro nucleotides adicionados durante pyrosequencing, o triphosphate do deoxyadenosine (a) está substituído com o triphosphate α-thio do deoxyadenosine para evitar um sinal falso da reacção adiantada com luciferase.
O método é limitado a ao redor 300-500 pares baixos do nucleotide, comparados com os comprimentos chain maiores sobre de arranjar em seqüência de utilização realizável de Sanger de 1000 pares baixos. É, contudo, menos caro e disponível no comércio.
Aplicações de pyrosequencing
Pyrosequencing
Pyrosequencing é usado para revelar o código genético de uma secção do ADN. Pode igualmente detectar únicos polimorfismo do nucleotide, inserção-supressões ou outras variações da seqüência, além do que poder determinar o methylation do ADN e a freqüência do alelo.
Por exemplo, as regiões do genoma associadas com uma desordem genética podem ser reduzidas para baixo mais para identificar genes específicos e variações dentro deles, ou uma resposta negativa herdada a determinadas drogas pode ser verificada antes que a droga esteja prescrita.
O método da resistência de droga em uma tensão nova das bactérias pode ser determinado por sua mudança genética comparada a um antepassado, ou o methylation epigenético do ADN em uma célula cancerosa pode ser detectado a fim determinar o melhor curso de tratamento.
Fontes:
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