Pyrosequencing es un método de secuencia de la DNA que descubra la luz emitida durante la adición secuencial de nucleótidos durante la síntesis de un cabo complementario de la DNA.
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Pyrosequencing se puede utilizar para descubrir la DNA y el ARN de casi cualquier fuente, y tiene usos en la investigación de la resistencia de las bacterias, el revelado de la droga, el epigenetics, y muchos otros campos.
Proceso de Pyrosequencing
Pyrosequencing ocurre en seis pasos importantes:
- La DNA que debe ser ordenada está fragmentada hacia arriba en los fragmentos de alrededor 100 pares bajos de DNA de una sola fila.
- Una reacción en cadena de polimerasa (PCR) se ejecuta para crear millones de copias idénticas de cada fragmento de la DNA, que están partidas a través de millares de pozos, con apenas un tipo de fragmento de la DNA por pozo.
- Los fragmentos de la DNA se incuban con la polimerasa de DNA, ATP-SULFURILASA, y las enzimas del apyrase, y la adenosina 5' los substratos del phosphosulfate y del luciferin.
- Uno de los cuatro tipos de nucleótidos que compongan la DNA se agrega a los pozos, que comienzan a ser incorporados sobre el patrón de una sola fila de la DNA por la polimerasa de DNA en el 3' extremo, liberando la ATP-SULFURILASA del pirofosfato después convierte el pirofosfato al trifosfato de adenosina (ATP) en presencia de la adenosina 5' phosphosulfate. El ATP entonces participa en la conversión luciferase-mediada del luciferin al oxyluciferin. Este proceso emite la luz proporcionalmente a la cantidad de ATP que participa en la conversión, que es tomada por un detector.
- Los nucleótidos y el ATP inusitados degradan al apyrase, permitiendo que la reacción comience otra vez con otro nucleótido. Este proceso se relanza, agregando cada nucleótido uno tras otro hasta que la síntesis sea completa.
- Un detector toma la intensidad de la luz emitida por el proceso, que entonces se utiliza para deducir el número y el tipo de nucleótidos adicionales. Por ejemplo, si tres nucleótidos de la citosina se agregan secuencialmente al mismo fragmento de la DNA, la luz emitida será tres veces más intensa que fragmentos de la DNA con solamente un nucleótido de la citosina adicional.
Si no se emite ninguna luz sobre la adición de la citosina, después la base elogiosa siguiente en el patrón de una sola fila de la DNA debe ser uno de los otros tres nucleótidos.
Debe ser observado que de los cuatro nucleótidos adicionales durante pyrosequencing, el trifosfato de la desoxiadenosina (a) está reemplazado por el trifosfato α-tio de la desoxiadenosina para evitar una señal falsa de la reacción temprana con luciferase.
El método se limita a alrededor 300-500 pares bajos del nucleótido, comparados con los mayores largos de cadena sobre de 1000 pares bajos realizables usando la secuencia de Sanger. Es, sin embargo, menos costoso y disponible en el comercio.
Usos de pyrosequencing
Pyrosequencing
Pyrosequencing se utiliza para revelar la clave genética de una sección de la DNA. Puede también descubrir los únicos polimorfismos del nucleótido, inserción-supresiones u otras variaciones de la serie, además de poder cuantificar la metilación de la DNA y la frecuencia del alelo.
Por ejemplo, las regiones del genoma asociadas a un desorden genético se pueden estrechar hacia abajo más lejos para determinar genes específicos y variaciones dentro de ellas, o una reacción negativa heredada a ciertas drogas puede ser verificada para antes de que se prescriba la droga.
El método de resistencia a los medicamentos en una nueva deformación de bacterias se puede determinar por su cambio genético comparado a un antepasado, o la metilación epigenética de la DNA en una célula cancerosa se puede descubrir para determinar el mejor curso del tratamiento.
Fuentes:
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