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Que le temps réel d'Unique-Molécule (SMRT) ordonnance-t-il ?

Saut à :

ADN ordonnançant des travaux à l'aide de l'ADN polymérase pour ajouter des nucléotides à une matrice. Il y a plusieurs technologies procurables pour l'ordonnancement d'ADN. Un tel exemple est ordonnancement en temps réel d'Unique-Molécule, ou ordonnancement de SMRT.

Guide de examen de transparence de séquence d
Guide de examen de transparence de séquence d'ADN de chercheur. Crédit : Shawn Hempel/Shutterstock

Comment l'ordonnancement de SMRT fonctionne-t-il ?

Comme avec l'autre ADN ordonnançant des technologies, la première étape après que l'extraction d'ADN soit de préparer une « bibliothèque ». Ce procédé prépare l'ADN pour l'ordonnancement ; dans ce cas, des adaptateurs sont ajoutés à l'un ou l'autre d'extrémité d'une molécule d'ADN bicaténaire, qui permet effectivement à l'ADN de devenir une matrice circulaire échouée unique. Ceci signifie alors que l'ADN peut être séquencé continuement.

Cette bibliothèque d'ADN, ou la matrice ADN, est alors mise dans un compteur séquentiel d'ADN qui contient les « guides d'ondes de zéro-mode » qui ont l'ADN polymérase immobilisé à une extrémité. Une molécule d'ADN unique est alors immobilisée dans ces guides d'ondes de zéro-mode, et l'ADN polymérase commence à ajouter les nucléotides neufs à un brin d'ADN synthétisé de novo complémentaire à la matrice ADN. Les bases en ces nucléotides sont marquées, et constitution de ces bases dans l'émission légère croissante de causes de brin d'ADN. Cette émission légère est alors affichée en temps réel, et car l'émission de chaque base est différente ceci tient compte pour que la base spécifique soit recensée.

Le principal avantage de l'ordonnancement de SMRT est le rétablissement longtemps de l'ordonnancement s'affiche de grande précision, qui améliore l'ensemble des génomes entiers. C'est parce que plus longtemps ordonnançant affiche le moyen que moins de « construction » est prié d'assembler le génome.

Introduction to SMRT Sequencing

Étude de la méthylation d'ADN dans les bactéries ; une application de l'ordonnancement de SMRT

Quelle est méthylation d'ADN ?

L'ajout d'un groupe méthylique à l'ADN, également connu sous le nom de méthylation, se produit dans tous les royaumes de durée. Il y a trois nucléotides méthylés actuels dans les bactéries ; m5C (5C-méthylique-cytosine, qui est également présent dans les eucaryotes), m6A (6N-méthylique-adénine) et m4C (4N-méthylique-cytosine, qui est seulement trouvée dans les bactéries). La méthylation se produit après la synthèse des brins d'ADN neufs, et se produit aux nucléotides spécifiques.

Les groupes méthyliques collent hors de la double helice d'ADN, et peuvent pour cette raison influencer le grippement entre les protéines obligatoires d'ADN et d'ADN. Ceci influence consécutivement des procédés comprenant le réglage de réplication de chromosome, de mésappariement d'ADN, ainsi que le calage de la transcription des gènes et la formation des lignées épigénétiques.

Mécanismes épigénétiques : la méthylation ou l
Mécanismes épigénétiques : la méthylation ou l'acétylation de l'ADN peut activer ou pas la transcription des gènes. Crédit d'image : ellepigrafica/Shutterstock

Pourquoi la méthylation d'ADN est-elle importante dans les bactéries ?

Les bactéries sont infectées par des virus, ont besoin pour cette raison d'un mécanisme de protection pour surmonter des viraux infection. C'est où les systèmes de restriction-modification entrent dans le jeu ; ce système se compose d'une enzyme de restriction, qui décompose l'ADN aux sites spécifiques, et d'une méthyltransférase d'ADN, qui ajoute un groupe méthylique à l'adénine (a) ou à la cytosine (c).

Dans la majorité de systèmes de restriction-modification, la méthyltransférase d'ADN agit de protéger l'ADN bactérien contre l'enzyme de restriction. La présence de la méthyltransférase d'ADN signifie que l'ADN bactérien devient méthylé, alors que l'ADN viral de infection n'est pas. Ceci signifie consécutivement que l'ADN viral est dégradé par l'enzyme de restriction, alors que l'ADN bactérien est dû protégé à l'enzyme de restriction n'agissant pas sur l'ADN méthylé. Cependant, il convient noter qu'il y a des enzymes de restriction qui agissent sur l'ADN modifié.

Les études récentes ont laissé entendre qu'il peut y avoir des rôles complémentaires pour des systèmes de restriction-modification. Par exemple, assommer certains systèmes de restriction-modification a eu comme conséquence une variation dans l'expression des gènes, qui est liée à la différence dans la méthylation d'ADN. les systèmes de Restriction-modification peuvent également entraîner les interruptions bicaténaires et les mutations de C-T, influençant de ce fait l'évolution des bactéries. Plus récent, on a développé des technologies qui peuvent déterminer la méthylation d'un génome bactérien entier, connu comme « methylome ».

Comment déterminez-vous le methylome utilisant l'ordonnancement de SMRT ?

Pendant que l'ordonnancement de SMRT donne des résultats en temps réel, il peut être employé pour trouver des modifications d'ADN comprenant des méthylations. L'ADN polymérase comporte des nucléotides à un débit constant, mais ce régime peut être changé si le nucléotide dans la matrice avait été modifié. Ceci peut être noté pendant le procédé de ordonnancement.

Soufflez à SMRT utilisé par Al ordonnançant pour tracer des modifications d'ADN dans 230 micros-organismes. Les modifications ils ont recherché m5C, m6A et m4C inclus. Les auteurs ont constaté que 93% de ces micros-organismes a montré la méthylation d'ADN, et ils ont également trouvé 834 motifs ce qui ont été méthylés. Ceci a permis aux auteurs de recenser quels motifs sont les objectifs pour 620 méthyltransférases d'ADN.

Intéressant, les auteurs ont noté que tandis que 48% des organismes étudiés avait une méthyltransférase d'ADN, il n'y avait aucune preuve d'une enzyme de restriction étant également présente. Par conséquent, c'est possible que la méthylation d'ADN joue un rôle majeur dans le règlement de génome, ou un rôle majeur différent dans les micros-organismes qui doit être recensé encore.

Sources

Further Reading

Last Updated: Sep 3, 2019

Dr. Maho Yokoyama

Written by

Dr. Maho Yokoyama

Dr. Maho Yokoyama is a researcher and science writer. She was awarded her Ph.D. from the University of Bath, UK, following a thesis in the field of Microbiology, where she applied functional genomics to Staphylococcus aureus . During her doctoral studies, Maho collaborated with other academics on several papers and even published some of her own work in peer-reviewed scientific journals. She also presented her work at academic conferences around the world.

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