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Che cosa il tempo reale della Unico Molecola (SMRT) sta ordinando?

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DNA che ordina gli impianti usando DNA polimerasi per aggiungere i nucleotidi ad un modello. Ci sono parecchie tecnologie disponibili per l'ordinamento del DNA. Un tale esempio è ordinamento in tempo reale della Unico Molecola, o ordinamento di SMRT.

Ricercatore che esamina la diapositiva della trasparenza di sequenza del DNA. Credito: Shawn Hempel/Shutterstock
Ricercatore che esamina la diapositiva della trasparenza di sequenza del DNA. Credito: Shawn Hempel/Shutterstock

Come l'ordinamento di SMRT funziona?

Come con l'altro DNA che ordina le tecnologie, il primo punto dopo che l'estrazione del DNA è di preparare “una libreria„. Questo trattamento prepara il DNA per l'ordinamento; in questo caso, i convertitori si aggiungono a qualsiasi estremità di una molecola di DNA a doppia elica, che efficacemente permette al DNA di trasformarsi in in un singolo modello circolare incagliato. Ciò poi significa che il DNA può essere ordinato continuamente.

Questa libreria del DNA, o il DNA del modello, poi è messa in un sequenziatore del DNA che contiene “le guide d'onda del zero-modo„ che hanno DNA polimerasi vincolata ad un'estremità. Una singola molecola del DNA poi è vincolata in queste guide d'onda del zero-modo e la DNA polimerasi comincia aggiungere i nuovi nucleotidi ad un filo del DNA sintetizzato novo di de complementare al DNA del modello. Le basi su questi nucleotidi sono contrassegnate ed incorporazione di queste basi nell'emissione di luce crescente di cause del filo del DNA. Questa emissione di luce poi è letta dentro tempo reale e poichè l'emissione da ogni base è differente questa tiene conto la base specifica essere identificata.

Il vantaggio principale di ordinamento di SMRT è la generazione lungamente di ordinamento legge di alta precisione, che migliora il montaggio di interi genoma. Ciò è perché più lungamente ordinando legge la media che meno “edilizia„ è richiesto per montare il genoma.

Introduction to SMRT Sequencing

Studio della metilazione del DNA in batteri; un'applicazione di ordinamento di SMRT

Che cosa è metilazione del DNA?

L'aggiunta di un gruppo metilico a DNA, anche conosciuta come metilazione, si presenta in tutti i regni di vita. Ci sono tre nucleotidi metilati presenti in batteri; m5C (5C-metilico-citosina, che è egualmente presente in eucarioti), m6A (6N-metilico-adenina) e m4C (4N-metilico-citosina, che è trovata soltanto in batteri). La metilazione si presenta dopo la sintesi di nuovi fili del DNA ed accade ai nucleotidi specifici.

I gruppi metilici attaccano dalla doppia elica del DNA e quindi possono urtare l'associazione fra le proteine obbligatorie del DNA e del DNA. Ciò a sua volta urta i trattamenti compreso la riparazione della replica del cromosoma, del disadattamento del DNA come pure la sincronizzazione della trascrizione del gene e la formazione di stirpi epigenetici.

Meccanismi epigenetici: la metilazione o l
Meccanismi epigenetici: la metilazione o l'acetilazione del DNA può attivare o non la trascrizione del gene. Credito di immagine: ellepigrafica/Shutterstock

Perché è la metilazione del DNA importante in batteri?

I batteri sono infettati dai virus, quindi hanno bisogno di un meccanismo protettivo di sormontare le infezioni virali. Ciò è dove i sistemi di restrizione-modifica entrano in gioco; questo sistema si compone di un enzima della restrizione, che riparte il DNA ai siti specifici e di un methyltransferase del DNA, che aggiunge un gruppo metilico ad adenina (A) o a citosina (C).

Nella maggior parte dei sistemi di restrizione-modifica, il methyltransferase del DNA agisce per proteggere il DNA batterico dall'enzima della restrizione. La presenza del methyltransferase del DNA significa che il DNA batterico è metilato, mentre il DNA virale d'infezione non è. Ciò a sua volta significa che il DNA virale è degradato dall'enzima della restrizione, mentre il DNA batterico è protetto dovuto l'enzima della restrizione che non agisce sul DNA metilato. Tuttavia, dovrebbe essere notato che ci sono enzimi della restrizione che agiscono su DNA modificato.

Gli studi recenti hanno suggerito che ci possono essere ruoli supplementari per i sistemi di restrizione-modifica. Per esempio, tramortire determinati sistemi di restrizione-modifica ha provocato un cambiamento nell'espressione genica, che è collegata alla differenza nella metilazione del DNA. i sistemi di Restrizione-modifica possono anche causare le rotture a doppia elica e le mutazioni di C-T, quindi influenzanti l'evoluzione dei batteri. Più recentemente, le tecnologie sono state sviluppate che possono determinare la metilazione di intero genoma batterico, conosciuto come “il methylome„.

Come determinate il methylome facendo uso dell'ordinamento di SMRT?

Mentre l'ordinamento di SMRT fornisce risultati in tempo reale, può essere usato per individuare le modifiche del DNA compreso i methylations. La DNA polimerasi incorpora i nucleotidi ad una tariffa costante, ma questa tariffa può essere cambiata se il nucleotide nel modello fosse stato modificato. Ciò può essere notata durante il trattamento d'ordinamento.

Soffi a SMRT usato Al che ordina per mappare le modifiche del DNA in 230 microrganismi. Le modifiche hanno cercato m5C, m6A e m4C inclusi. Gli autori hanno trovato che 93% di questi microrganismi ha mostrato la metilazione del DNA ed egualmente hanno trovato 834 motivi quale sono stati metilati. Ciò ha permesso agli autori di identificare quali motivi sono gli obiettivi per 620 methyltransferases del DNA.

Interessante, gli autori hanno notato che mentre 48% degli organismi studiati ha avuto un methyltransferase del DNA, non c'era prova di un enzima della restrizione anche che è presente. Di conseguenza, è ruolo possibile che la metilazione del DNA svolga un ruolo importante nel regolamento del genoma, o un altro importante in microrganismi che deve ancora essere identificato.

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Last Updated: Sep 3, 2019

Dr. Maho Yokoyama

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Dr. Maho Yokoyama

Dr. Maho Yokoyama is a researcher and science writer. She was awarded her Ph.D. from the University of Bath, UK, following a thesis in the field of Microbiology, where she applied functional genomics to Staphylococcus aureus . During her doctoral studies, Maho collaborated with other academics on several papers and even published some of her own work in peer-reviewed scientific journals. She also presented her work at academic conferences around the world.

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