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Que o tempo real da Único-Molécula (SMRT) está arranjando em seqüência?

Faixa clara a:

ADN que arranja em seqüência trabalhos usando a polimerase de ADN para adicionar nucleotides a um molde. Há diversas tecnologias disponíveis para arranjar em seqüência do ADN. Um tal exemplo é tempo real da Único-Molécula que arranjam em seqüência, ou arranjar em seqüência de SMRT.

Pesquisador que examina a corrediça da transparência da seqüência do ADN. Crédito: Shawn Hempel/Shutterstock
Pesquisador que examina a corrediça da transparência da seqüência do ADN. Crédito: Shawn Hempel/Shutterstock

Como arranjar em seqüência de SMRT trabalha?

Como com o outro ADN que arranja em seqüência tecnologias, a primeira etapa depois que a extracção do ADN é preparar uma “biblioteca”. Este processo prepara o ADN para arranjar em seqüência; neste caso, os adaptadores são adicionados a uma ou outra extremidade de uma molécula encalhada dobro do ADN, que permita eficazmente o ADN de se transformar um único molde circular encalhado. Isto significa então que o ADN pode ser arranjado em seqüência continuamente.

Esta biblioteca do ADN, ou o ADN do molde, são postos então em um sequencer do ADN que contenha do “os medidores de ondas zero-modo” que têm a polimerase de ADN imobilizada em uma extremidade. Uma única molécula do ADN é imobilizada então nestes medidores de ondas do zero-modo, e a polimerase de ADN começa adicionar nucleotides novos a uma costa sintetizada novo do ADN de complementar ao ADN do molde. As bases nestes nucleotides são etiquetadas, e incorporação destas bases na emissão clara crescente das causas da costa do ADN. Esta emissão clara é lida então dentro tempo real, e como a emissão de cada base é diferente esta permite a base específica ser identificada.

A vantagem principal de arranjar em seqüência de SMRT é a geração por muito tempo de arranjar em seqüência lê da precisão alta, que melhora o conjunto de genomas inteiros. Isto é porque mais por muito tempo arranjando em seqüência lê o meio que menos “construção” é exigido para montar o genoma.

Introduction to SMRT Sequencing

Estudando o Methylation do ADN nas bactérias; uma aplicação de arranjar em seqüência de SMRT

Que é methylation do ADN?

A adição de um grupo metílico ao ADN, igualmente conhecida como o methylation, ocorre em todos os reinos da vida. Há três nucleotides misturados actuais nas bactérias; m5C (5C-metílico-cytosine, que está igualmente actual nos eukaryotes), m6A (6N-metílico-adenina) e m4C (4N-metílico-cytosine, que é encontrado somente nas bactérias). O Methylation ocorre após a síntese de costas novas do ADN, e acontece em nucleotides específicos.

Os grupos metílicos colam fora da hélice dobro do ADN, e podem conseqüentemente impactar o emperramento entre proteínas obrigatórias do ADN e do ADN. Isto impacta por sua vez os processos que incluem o reparo da réplica do cromossoma, da má combinação do ADN, assim como cronometrar da transcrição do gene e a formação de linhagens epigenéticas.

Mecanismos epigenéticos: o methylation ou a acetificação do ADN podem activar ou não a transcrição do gene. Crédito de imagem: ellepigrafica/Shutterstock
Mecanismos epigenéticos: o methylation ou a acetificação do ADN podem activar ou não a transcrição do gene. Crédito de imagem: ellepigrafica/Shutterstock

Por que é o methylation do ADN importante nas bactérias?

As bactérias são contaminadas por vírus, precisam conseqüentemente um mecanismo protector de superar infecções virais. Isto é o lugar aonde os sistemas da limitação-alteração entram o jogo; este sistema é compo de uma enzima da limitação, que divida o ADN em locais específicos, e de um methyltransferase do ADN, que adicione um grupo metílico à adenina (a) ou ao cytosine (c).

Na maioria de sistemas da limitação-alteração, o methyltransferase do ADN actua para proteger o ADN bacteriano da enzima da limitação. A presença do methyltransferase do ADN significa que o ADN bacteriano se torna misturado, quando o ADN viral de contaminação não for. Isto significa por sua vez que o ADN viral está degradado pela enzima da limitação, quando o ADN bacteriano for protegido devido à enzima da limitação que não actua no ADN misturado. Contudo, deve-se notar que há as enzimas da limitação que actuam no ADN alterado.

Os estudos recentes sugeriram que pode haver uns papéis adicionais para sistemas da limitação-alteração. Por exemplo, bater para fora determinados sistemas da limitação-alteração conduziu a uma mudança na expressão genética, que é ligada à diferença no methylation do ADN. os sistemas da Limitação-alteração podem igualmente causar rupturas dobro-encalhadas e mutações do C-T, influenciando desse modo a evolução das bactérias. Mais recentemente, as tecnologias foram desenvolvidas que podem determinar o methylation de um genoma bacteriano inteiro, sabido como o “methylome”.

Como você determina o methylome usando arranjar em seqüência de SMRT?

Enquanto arranjar em seqüência de SMRT dá resultados do tempo real, pode ser usado para detectar alterações do ADN incluir methylations. A polimerase de ADN incorpora nucleotides em uma taxa constante, mas esta taxa pode ser mudada se o nucleotide no molde tinha sido alterado. Isto pode ser notado durante o processo arranjando em seqüência.

Funda em SMRT usado al. que arranja em seqüência para traçar alterações do ADN em 230 micro-organismos. As alterações procuraram m5C, m6A e m4C incluídos. Os autores encontraram que 93% destes micro-organismos mostrou o methylation do ADN, e igualmente encontraram 834 motivos quais foram misturados. Isto permitiu os autores de identificar que motivos são os alvos para 620 methyltransferases do ADN.

Interessante, os autores notaram que quando 48% dos organismos estudados teve um methyltransferase do ADN, não havia nenhuma evidência de uma enzima da limitação igualmente que esta presente. Conseqüentemente, é papel possível que o methylation do ADN joga um papel importante no regulamento do genoma, ou outro importante nos micro-organismos que deve ser identificada ainda.

Fontes

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Last Updated: Sep 3, 2019

Dr. Maho Yokoyama

Written by

Dr. Maho Yokoyama

Dr. Maho Yokoyama is a researcher and science writer. She was awarded her Ph.D. from the University of Bath, UK, following a thesis in the field of Microbiology, where she applied functional genomics to Staphylococcus aureus . During her doctoral studies, Maho collaborated with other academics on several papers and even published some of her own work in peer-reviewed scientific journals. She also presented her work at academic conferences around the world.

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