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Quel est transfert d'ADN ?

Éponger est le procédé par lequel l'ADN, l'ARN ou les protéines sont transférés sur une membrane afin de pour être conçus.

Crédit : Paul Cowan/Shutterstock.com

Le premier de ces méthodes était transfert d'ADN, s'est développé en 1975 par Edouard du sud, et est employé pour trouver la séquence des fragments d'ADN. Depuis lors, deux autres méthodes ont été développées, Northern appelé et Western blotting. Ce sont des procédés qui sont employés pour recenser l'ARN et les séquences protéiques, respectivement.

Méthodologie du transfert d'ADN

Des fragments d'ADN sont au commencement produits avec des enzymes de restriction et séparés par taille dans une électrophorèse en gel appelée de processus. Alcaline est alors employé pour dénaturer l'ADN doubler-échoué, formant des monocaténaires. L'ADN est alors transféré sur une nitrocellulose ou une feuille de nylon en mettant une membrane au-dessus du gel et en employant le flux du tampon pour encourager le mouvement de l'ADN du gel à la membrane.

Le flux capillaire et le transfert d'aspirateur sont les deux la plupart des méthodes classiques employées pour transférer les fragments d'ADN. Dans le flux capillaire, le gel est mis au-dessus du niveau du tampon sur une case de support avec une membrane mise sur le haut. Une pile d'essuie-main absorbants sont alors mises au-dessus de la membrane et sont employées pour absorber le tampon de sous le gel, soulevant les fragments d'ADN sur la membrane.

Utilisant le transfert d'aspirateur, la membrane est mise sous le gel et les deux sont submergés dans le tampon. Un aspirateur est alors employé pour produire un flux qui tirent les fragments d'ADN vers le bas sur la membrane.

Le chauffage ou le rayonnement UV sont alors employés pour s'assurer que les fragments d'ADN demeurent fixés à la membrane de manière permanente, tout en mettant à jour l'agencement spécifique de l'ADN. Des sondes marquées monocatenaires sont alors employées pour gripper pour viser des séquences.

La feuille est incubée avec ces sondes et seulement les sondes complémentaires grippent. Les sondes non-complémentaires sont alors délogées de la membrane, s'assurant que seulement les sondes attachées demeurent. Ces sondes peuvent alors être trouvées par l'autoradiographie pour indiquer la configuration de l'hybridation sur un film radiographique.

Applications du transfert d'ADN

Le transfert d'ADN a beaucoup de différentes utilisations. Premièrement, des réarrangements génétiques peuvent s'analyser. Par exemple, en immunologie cette méthode peut être employée pour recenser les réarrangements clonaux des gènes du récepteur à cellule T. Deuxièmement, des fragments d'ADN spécifiques peuvent être recensés d'un mélange de beaucoup d'autres éclats.

D'autres exemples des utilisations comprennent le polymorphisme de longueur d'éclat de restriction (RFLP) et l'analyse variable de séquence répétée en tandem (VNTR) de numéro. Le PLFR emploie les différences dans la longueur dans des séquences d'ADN homologues pour tracer des génomes, et peut être employé dans les tests légaux et de paternité.

L'analyse de VNTR emploie les différences dans la longueur des séquences de nucléotides répétées pour former une empreinte digital d'ADN, une méthode qui est utilisée généralement dans la paternité et le contrôle légal.

Ces méthodes peuvent également être employées dans le diagnostic de la maladie provoqué par mutation, par exemple anémie de cellule falciforme. Cet état génétique est dû à un polymorphisme unique de nucléotide (A à T) dans le gène de bêta-globine, ayant pour résultat l'hémoglobine anormale.

Transfert d'ADN pour le syndrome du X fragile

Des taches du sud ont été employées considérable pour aider à recenser des gènes avec des régions amplifiées de répétition. Ce sont des séquences courtes et répétitives dans l'ADN qui ne codent pas des produits de gène. Un exemple où le transfert d'ADN peut être utile est dans le diagnostic du syndrome du X fragile. Cet état génétique est dû à l'augmentation de la région de répétition de CGG/CCG qui est située dans le gène FMR1.

Ce gène contient habituellement entre 5-40 régions de répétition. Les personnes avec 55-200 répétitions ont un premutation du gène FMR1, et les personnes avec les répétitions >200 ont le syndrome du X fragile. L'augmentation des répétitions mène à la méthylation du gène, qui empêche la transcription et évite la production de la protéine de FMRP. Cette protéine est exigée pour le fonctionnement normal du système nerveux, pour cette raison la perte de fonctionnement de protéine mène aux sympt40mes du syndrome du X fragile.

Dans le diagnostic, l'enzyme méthylation-sensible EclX1 de restriction et l'enzyme Méthylation-peu sensible EcoR1 sont employées pour permettre la différenciation des allèles méthylés et des allèles non-méthylés. Des allèles méthylés sont coupés seulement une fois pour donner un fragment d'ADN singulier du kb 5,1.

Toutefois des allèles non-méthylés sont coupés deux fois, produisant un éclat du kb 2,8. les répétitions Non-méthylées de premutation (<200) peuvent pour cette raison être distinguées des répétitions méthylées de mutation d'environ 200 répétitions longtemps, pendant que le transfert d'ADN peut être employé pour recenser les tailles des fragments d'ADN.

Futurs points de vue

De façon générale, le transfert d'ADN est une technique important dans le diagnostic et l'étude de la maladie (telle que l'anémie de syndrome du X fragile et de cellule falciforme) et de l'analyse de l'ADN pour d'autres raisons (telles que le contrôle légal et de paternité).

Cependant, le transfert d'ADN est très techniquement complexe, cher, laborieux et exige une grande quantité d'échantillon d'ADN. Les méthodes neuves pour cette raison remontent lentement le transfert d'ADN, par exemple ACP de temps réel. Ce procédé est beaucoup plus facile et plus rapidement que le transfert d'ADN et exige seulement un volume d'ADN très petit.

Sources :

Further Reading

Last Updated: Feb 26, 2019

Hannah Simmons

Written by

Hannah Simmons

Hannah is a medical and life sciences writer with a Master of Science (M.Sc.) degree from Lancaster University, UK. Before becoming a writer, Hannah's research focussed on the discovery of biomarkers for Alzheimer's and Parkinson's disease. She also worked to further elucidate the biological pathways involved in these diseases. Outside of her work, Hannah enjoys swimming, taking her dog for a walk and travelling the world.

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