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Che cosa è macchiare del sud?

Macchiare è il trattamento tramite cui il DNA, il RNA o le proteine sono trasferiti su una membrana per essere visualizzati.

Credito: Paul Cowan/Shutterstock.com

Il primo di questi metodi era macchiare del sud, si è sviluppato nel 1975 da Edward del sud ed è usato per individuare la sequenza delle sequenze di DNA. Da allora, altri due metodi sono stati messi a punto, chiamato Northern e macchiare occidentale. Questi sono rispettivamente trattamenti che sono usati per identificare le sequenze della proteina e del RNA.

Metodologia di macchiare del sud

Le sequenze di DNA inizialmente sono generate con gli enzimi della restrizione e sono separate dalla dimensione in un trattamento chiamato l'elettroforesi del gel. Alcalino poi è usato per denaturare il DNA raddoppiare-incagliato, formante i singoli fili. Il DNA poi è trasferito su una nitrocellulosa o su una lamiera sottile del nylon il collocamento della membrana sopra il gel ed usando il flusso del buffer per incoraggiare il movimento di DNA dal gel alla membrana.

Il flusso capillare ed il trasferimento di vuoto sono i due metodi più comuni impiegati per trasferire le sequenze di DNA. Nel flusso capillare, il gel è collocato sopra il livello di buffer su un blocco supportante con una membrana collocata sulla cima. Una pila di asciugamani assorbenti poi è collocata sopra la membrana ed è usata per assorbire il buffer sotto dal gel, sollevante le sequenze di DNA su sulla membrana.

Facendo uso del trasferimento di vuoto, la membrana è collocata sotto il gel ed entrambi sono sommersi in buffer. Un vuoto poi è usato per creare un flusso che tirano le sequenze di DNA giù sulla membrana.

Il riscaldamento o la radiazione UV poi è usata per assicurare che le sequenze di DNA rimangano fissate permanentemente alla membrana, mentre mantenendo la disposizione specifica di DNA. le sonde contrassegnate Unico incagliate poi sono usate per legare per mirare alle sequenze.

La lamiera sottile è incubata con queste sonde e soltanto le sonde complementari legano. Le sonde non complementari poi sono lavate dalla membrana, assicurandosi che soltanto le sonde rilegate rimangano. Queste sonde possono poi essere individuate da autoradiografia per rivelare il reticolo dell'ibridazione su una lastra radioscopica.

Applicazioni di macchiare del sud

Macchiare del sud ha molti usi differenti. In primo luogo, le riorganizzazioni di gene possono essere analizzate. Per esempio, in immunologia questo metodo può essere usato per identificare le riorganizzazioni clonali dei geni di recettore delle cellule t. Secondariamente, i frammenti specifici di DNA possono essere identificati dall'interno di una miscela di molti altri frammenti.

Altri esempi degli usi comprendono sia il polimorfismo di lunghezza di frammento di restrizione (RFLP) che l'analisi variabile di ripetizione in tandem (VNTR) di numero. Il RFLP utilizza le differenze nella lunghezza nelle sequenze omologhe del DNA per mappare i genoma e può essere utilizzato nelle prove di paternità e legali.

L'analisi di VNTR utilizza le differenze nella lunghezza delle sequenze di nucleotide ripetute per formare un'impronta digitale del DNA, un metodo che è comunemente usato nella paternità ed in prova legale.

Questi metodi possono anche essere utilizzati nella diagnosi della malattia causata dalla mutazione, per esempio anemia falciforme. Questo stato genetico è dovuto un singolo polimorfismo del nucleotide (A a T) nel gene della beta-globina, con conseguente emoglobina anormale.

Macchiare del sud per il sindrome dell'x fragile

Le macchie del sud sono state usate estesamente per contribuire ad identificare i geni con le regioni ampliate di ripetizione. Queste sono brevi, sequenze ripetitive in DNA che non codificano i prodotti del gene. Un esempio dove macchiare del sud può essere utile è nella diagnosi del sindrome dell'x fragile. Questo stato genetico è dovuto l'aumento nella regione di ripetizione di CGG/CCG che è situata all'interno del gene FMR1.

Questo gene contiene solitamente fra 5-40 regioni di ripetizione. Le persone con 55-200 ripetizioni hanno un premutation del gene FMR1 e le persone con le ripetizioni >200 hanno sindrome dell'x fragile. L'aumento nelle ripetizioni piombo a metilazione del gene, che inibisce la trascrizione ed impedisce la produzione della proteina di FMRP. Questa proteina è richiesta per la funzione normale del sistema nervoso, quindi la perdita di funzione della proteina piombo ai sintomi del sindrome dell'x fragile.

Nella diagnosi, ad enzima metilazione sensibile EclX1 della restrizione e l'enzima Metilazione-insensibile EcoR1 sono usati per permettere la differenziazione degli alleli metilati e degli alleli non metilati. Gli alleli metilati sono tagliati soltanto una volta per dare una sequenza di DNA singolare di 5,1 KB.

Comunque gli alleli non metilati sono tagliati due volte, producendo un frammento di 2,8 KB. le ripetizioni Non metilate di premutation (<200) possono quindi essere distinte dalle ripetizioni metilate di mutazione di intorno 200 ripetizioni lungamente, come macchiare del sud possono essere usate per identificare le dimensioni delle sequenze di DNA.

Prospettive future

Macchiare globale e del sud è un metodo importante nella diagnosi e nello studio sulla malattia (quali il sindrome dell'x fragile e l'anemia falciforme) e sull'analisi di DNA per altre ragioni (come prova di paternità e legale).

Tuttavia, macchiare del sud è molto tecnicamente complesso, costoso, laborioso e richiede un gran quantità di campione del DNA. I nuovi metodi quindi stanno sostituendo lentamente macchiare del sud, per esempio PCR in tempo reale. Questo trattamento è macchiare molto più facile e più velocemente del sud e soltanto richiede un volume di DNA molto piccolo.

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Last Updated: Feb 26, 2019

Hannah Simmons

Written by

Hannah Simmons

Hannah is a medical and life sciences writer with a Master of Science (M.Sc.) degree from Lancaster University, UK. Before becoming a writer, Hannah's research focussed on the discovery of biomarkers for Alzheimer's and Parkinson's disease. She also worked to further elucidate the biological pathways involved in these diseases. Outside of her work, Hannah enjoys swimming, taking her dog for a walk and travelling the world.

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