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Que é mancha do sul?

Borrar é o processo por que o ADN, o RNA ou as proteínas são transferidos em uma membrana a fim ser visualizados.

Crédito: Paul Cowan/Shutterstock.com

O primeiro destes métodos era mancha do sul, tornava-se em 1975 por Edward do sul, e é usado para detectar a seqüência de fragmentos do ADN. Desde então, outros dois métodos foram desenvolvidos, chamado Do norte e mancha ocidental. Estes são os processos que são usados para identificar seqüências do RNA e da proteína, respectivamente.

Metodologia da mancha do sul

Os fragmentos do ADN inicialmente são gerados com enzimas da limitação e separados pelo tamanho em um processo chamado electroforese do gel. Alcalino é usado então para desnaturar o ADN dobrar-encalhado, formando únicas costas. O ADN é transferido então em uma nitrocelulose ou em uma folha do nylon colocando uma membrana sobre o gel e usando o fluxo do amortecedor para incentivar o movimento do ADN do gel à membrana.

O fluxo capilar e transferência do vácuo são os dois métodos os mais comuns usados para transferir os fragmentos do ADN. No fluxo capilar, o gel é colocado acima do nível de amortecedor em um bloco de apoio com uma membrana colocada na parte superior. Uma pilha de toalhas absorventes então é colocada sobre a membrana e usada para absorver o amortecedor abaixo do gel, levantando os fragmentos do ADN acima na membrana.

Usando transferência do vácuo, a membrana é colocada abaixo do gel e ambos são submergidos no amortecedor. Um vácuo é usado então para criar um fluxo que puxam os fragmentos do ADN para baixo na membrana.

O aquecimento ou a radiação UV são usados então para assegurar-se de que os fragmentos do ADN permaneçam anexados à membrana permanentemente, enquanto mantendo o regime específico do ADN. as pontas de prova etiquetadas Único-encalhadas são usadas então para ligar para visar seqüências.

A folha é incubada com estas pontas de prova e somente as pontas de prova complementares ligam. As pontas de prova não-complementares são lavadas então da membrana, assegurando-se de que somente as pontas de prova encadernadas permaneçam. Estas pontas de prova podem então ser detectadas pela autoradiografia para revelar o teste padrão da hibridação em um filme de raio X.

Aplicações da mancha do sul

A mancha do sul tem muitos usos diferentes. Em primeiro lugar, os rearranjos de gene podem ser analisados. Por exemplo, na imunologia este método pode ser usado para identificar os rearranjos clonal de genes de célula T do receptor. Em segundo lugar, os fragmentos específicos do ADN podem ser identificados de dentro de uma mistura de muitos outros fragmentos.

Outros exemplos de usos incluem o polimorfismo de comprimento de fragmento de limitação (RFLP) e a análise variável da repetição em tandem (VNTR) do número. O RFLP usa as diferenças de comprimento em seqüências homólogos do ADN para traçar genomas, e pode ser usado em testes judiciais e de paternidade.

A análise de VNTR usa as diferenças de comprimento de seqüências de nucleotide repetidas para formar uma impressão digital do ADN, um método que seja de uso geral na paternidade e no teste judicial.

Estes métodos podem igualmente ser usados no diagnóstico da doença causado pela mutação, por exemplo anemia da célula falciforme. Esta condição genética é devido a um único polimorfismo do nucleotide (A a T) no gene da beta-globina, tendo por resultado a hemoglobina anormal.

Mancha do sul para a síndrome frágil de X

As manchas do sul foram usadas extensivamente para ajudar a identificar genes com regiões amplificadas da repetição. Estas são as seqüências curtos, repetitivas no ADN que não codificam produtos do gene. Um exemplo onde a mancha do sul pode ser útil está no diagnóstico da síndrome frágil de X. Esta condição genética é devido ao aumento na região da repetição de CGG/CCG que é ficada situada dentro do gene FMR1.

Este gene contem geralmente entre 5-40 regiões da repetição. Os indivíduos com 55-200 repetições têm um premutation do gene FMR1, e os indivíduos com repetições >200 têm a síndrome frágil de X. O aumento nas repetições conduz ao methylation do gene, que inibe a transcrição e impede a produção da proteína de FMRP. Esta proteína é exigida para a função normal do sistema nervoso, conseqüentemente a perda de função da proteína conduz aos sintomas da síndrome frágil de X.

No diagnóstico, a enzima methylation-sensível EclX1 da limitação e a enzima Methylation-insensível EcoR1 são usadas para permitir a diferenciação de alelos misturados e de alelos não-misturados. Os alelos misturados são cortados somente uma vez para dar um fragmento singular do ADN do kb 5,1.

Porém os alelos não-misturados são cortados duas vezes, produzindo um fragmento do kb 2,8. as repetições Não-misturadas do premutation (<200) podem conseqüentemente ser distintas das repetições misturadas da mutação de ao redor 200 repetições por muito tempo, como a mancha do sul podem ser usadas para identificar os tamanhos dos fragmentos do ADN.

Perspectivas futuras

A mancha total, do sul é um método importante no diagnóstico e no estudo da doença (tal como a síndrome de X e a anemia frágeis da célula falciforme) e da análise do ADN por outras razões (como o teste judicial e da paternidade).

Contudo, a mancha do sul é muito tècnica complexa, cara, laboriosa e exige uma grande quantidade de amostra do ADN. Os métodos novos conseqüentemente estão substituindo lentamente a mancha do sul, por exemplo PCR do tempo real. Este processo é uma mancha muito mais fácil e mais rapidamente do que do sul e exige somente um volume muito pequeno de ADN.

Fontes:

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Last Updated: Feb 26, 2019

Hannah Simmons

Written by

Hannah Simmons

Hannah is a medical and life sciences writer with a Master of Science (M.Sc.) degree from Lancaster University, UK. Before becoming a writer, Hannah's research focussed on the discovery of biomarkers for Alzheimer's and Parkinson's disease. She also worked to further elucidate the biological pathways involved in these diseases. Outside of her work, Hannah enjoys swimming, taking her dog for a walk and travelling the world.

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