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Quelle est spectroscopie Temps-Resolved de fluorescence ?

la spectroscopie Temps-resolved de fluorescence est une technique de spectroscopie employée pour surveiller des interactions entre les molécules et les mouvements qui se produisent pendant les courtes périodes. La capacité de mesurer des changements de la gamme de temps de picoseconde ou de nanoseconde lui effectue une technique utile en analyse et dynamique de structure biomoléculaires.

Neurones par la fluorescence

Crédit d'image : Juan Gaertner/Shutterstock.com

Les éléments de la spectroscopie temps-resolved de fluorescence

la spectroscopie Temps-resolved de fluorescence peut trouver des événements dans un environnement fluorophore. Les événements qui peuvent être mesurés sont délabrement, indiqué par une diminution de la fluorescence après l'excitation, et délabrement d'anisotropie de polarisation, où la réorientation du doublet d'émission pendant l'excitation est mesurée.

Travaux temps-resolved mesurés de spectroscopie de fluorescence de délabrement basés sur la durée de la condition enthousiaste, qui peut être diminuée par certains événements dynamiques comprenant les modifications macromoléculaires de conformation, la relaxation dissolvante, la rotation de chaîne latérale, les interactions entre les résidus voisins, et d'autres changements de l'environnement local. La variation a lieu de quelques picosecondes seulement ou les dizaines de nanosecondes, signifiant les modifications mesurables doivent se produire dans cette marge de temps. Les développements dans ce type de mesure permettent pour comprendre l'information structurelle, par exemple en discernant des distances entre les sondes.

La spectroscopie temps-resolved de fluorescence de délabrement d'anisotropie de polarisation peut être employée pour comprendre le mouvement de la mobilité fluorophore et segmentaire, ou la rotation d'une macromolécule entière. Ceci permet à la méthode de mesurer des caractéristiques sur l'hydrodynamique, qui est la diffusion rotationnelle des protéines ou des acides nucléiques. À cause de la gamme de dépistage de picoseconde de la spectroscopie temps-resolved de fluorescence, il peut également être employé pour mesurer la dynamique interne des macromolécules qui peuvent potentiellement confirmer des prévisions théoriques de dynamique moléculaire.

Applications de protéine de la spectroscopie temps-resolved de fluorescence

Selon la macromolécule à l'orientation, la méthode et l'application changent légèrement. En étudiant des protéines, le délabrement de fluorescence qui est mesuré est le plus souvent des résidus de tryptophane. La caractéristique a prouvé que le délabrement de fluorescence de tryptophane est sensible à l'environnement local, qui lui effectue une sonde très utile pour des études sur la structure des protéines et la dynamique. En outre, donné que beaucoup de protéines ont seulement un résidu de tryptophane, le désavantage de l'évaluation compliquée de caractéristiques peut être évité.

Tandis que le tryptophane est la sonde favorisée pour des études sur la structure des protéines et dynamique, il n'est pas très utile pour des études d'interaction protéine-protéine dues aux signes compliqués de fluorescence quand deux protéines ou plus sont mélangées. Les solutions de rechange sont en pareil cas l'azatryptophan 5 le hydroxytryptophan (5-OH-Trp) et 7 (7-aza-Trp). Ce sont dus utile à leur capacité sélecteur d'exciter et observer leur fluorophore, même dans le même environnement que d'autres protéines tryptophane-contenantes. Par exemple, 5-OH-Trp a été employé pour produire un analogue d'insuline pour des études sur des interactions de récepteur hormonal.

Applications d'ADN de la spectroscopie temps-resolved de fluorescence

La fluorescence intrinsèque de l'ADN est habituellement très faible, qui a mené aux teintures étant employées en tant que marques. Les avances dans ce domaine ont vu les sondes fluorescentes étant ajoutées, et la spectroscopie temps-resolved de fluorescence est devenue de plus en plus une technique important en étudiant l'ADN et les composés d'ADN-protéine. Par exemple, DAPI, un cahier d'incision, a été employé pendant qu'une sonde pour étudier des mouvements d'ADN utilisant l'anisotropie diminuent des méthodes.

Des méthodes intrinsèques de fluorescence ont été également employées, comme ceux qui utilisent des bases de thymines. Les études utilisant des bases de thymines en oligonucléotides et polynucléotides bicaténaires ont indiqué des mouvements d'ADN avec la grande amplitude aux temps de corrélation de sous-nanoseconde.

Les études des composés d'ADN-protéine peuvent employer l'émission de tryptophane de protéine ou la vie fluorescente des sondes ADN. Par exemple, utilisant l'émission de tryptophane de TBP, on lui a montré que TBP transforme d'un multimer à un composé monomérique sur le grippement d'ADN. Utilisant la fluorescéine une sonde a ajouté à ADN, les points de contact entre la protéine de réglementation de TyrR et l'ADN pourrait être trouvé.

Avantages et désavantages

la spectroscopie Temps-resolved de fluorescence a plusieurs avantages liés à ses méthodes. Les méthodes de mesure dépendent de la vie de la fluorescence, et car tel n'est pas généralement affecté par des différences dans la concentration des fluorophores, intensité de l'illumination, la longueur de trajet de la lumière, ou de photobleaching, qui peut affecter d'autres types de spectroscopie de fluorescence.

En outre, la caractéristique acquise signifie que l'environnement local du fluorophore peut directement être quantitativement mesuré. Ceci signifie que des caractéristiques sur la viscosité de l'environnement, l'indice de réfraction, le pH, et d'autres paramètres peuvent être mesurées sans besoin d'analyses biochimiques qui compromettent la cellule.

Les désavantages de la spectroscopie temps-resolved de fluorescence sont souvent liés à l'analyse des caractéristiques. Pour un, les protéines fluorescentes ont souvent fluorescent compliqué diminue, qui rend nécessaire certaines compétences pour l'évaluation de caractéristiques. De même, si la vie de fluorescence subit les modifications spécifiques, les raisons biochimiques peuvent ne pas être facilement perceptibles sans conseil d'expert. Pour finir, le matériel requis pour la spectroscopie temps-resolved de fluorescence est complexe et coûteux.

Sources

  1. Suhling, K. et autres (2005). microscopie à fluorescence Temps-resolved. Les sciences photochimiques et photobiologiques. https://doi.org/10.1039/B412924P
  2. Millar, D.P. (1996). spectroscopie Temps-resolved de fluorescence. Opinion actuelle dans la biologie structurelle. https://doi.org/10.1016/S0959-440X(96)80030-3

Last Updated: Jan 17, 2020

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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