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Che cosa è la spettroscopia Del tempo Risolta della fluorescenza?

la spettroscopia Del tempo risolta della fluorescenza è una tecnica della spettroscopia usata per riflettere le interazioni fra le molecole ed i moti che si presentano nei corti periodi. La capacità di misurare i cambiamenti nell'intervallo di tempo di nanosecondo o di picosecondo le rende una tecnica utile nell'analisi strutturale e nella dinamica biomolecolari.

Neuroni segnati con fluorescenza

Credito di immagine: Juan Gaertner/Shutterstock.com

Le basi della spettroscopia del tempo risolta di fluorescenza

la spettroscopia Del tempo risolta della fluorescenza può individuare gli eventi all'interno di un ambiente fluorophore. Gli eventi che possono essere misurati sono disintegrazione, indicata tramite una diminuzione nella fluorescenza dopo l'eccitazione e disintegrazione dell'anisotropia di polarizzazione, dove il riorientamento del dipolo dell'emissione durante l'eccitazione è misurato.

Attività del tempo risolte misurate di spettroscopia di fluorescenza di disintegrazione basate sulla durata dello stato eccitato, che può essere accorciato da determinati eventi dinamici compreso i cambiamenti macromolecolari di conformazione, il rilassamento solvente, la rotazione della catena laterale, le interazioni fra i residui vicini ed altri cambiamenti nell'ambiente locale. La variazione ha luogo soltanto di alcuni picosecondi o i dieci dei nanosecondi, significanti i cambiamenti misurabili devono accadere all'interno di questo intervallo di tempo. Gli sviluppi in questo tipo di misura stanno permettendo di capire le informazioni strutturali, per esempio discernendo le distanze fra le sonde.

La spettroscopia del tempo risolta della fluorescenza di disintegrazione dell'anisotropia di polarizzazione può essere usata per capire il movimento della mobilità fluorophore e segmentale, o la rotazione di intera macromolecola. Ciò permette al metodo di misurare i dati su idrodinamica, che è la diffusione rotazionale delle proteine o degli acidi nucleici. A causa dell'intervallo di rilevazione di picosecondo della spettroscopia del tempo risolta della fluorescenza, può anche essere usata per misurare la dinamica interna delle macromolecole che possono potenzialmente confermare le previsioni teoriche della dinamica molecolare.

Applicazioni della proteina della spettroscopia del tempo risolta di fluorescenza

Secondo la macromolecola a fuoco, il metodo e l'applicazione cambiano leggermente. Nel studiare le proteine, la disintegrazione di fluorescenza che è misurata proviene il più spesso dai residui del triptofano. I dati hanno indicato che la disintegrazione di fluorescenza del triptofano è sensibile all'ambiente locale, che gli rende una sonda molto utile per gli studi sulla struttura e sulla dinamica della proteina. Ancora, dato che molte proteine hanno soltanto un residuo del triptofano, lo svantaggio dell'interpretazione complicata di dati può essere aggirato.

Mentre il triptofano è la sonda favorita per gli studi sulla struttura della proteina e dinamica, non è molto utile per gli studi di interazione della proteina-proteina dovuto i segnali complicati della fluorescenza quando due o più proteine sono miste. Le alternative in tali casi sono 5 hydroxytryptophan (5-OH-Trp) e 7 azatryptophan (7-aza-Trp). Questi sono utile dovuto la loro capacità di eccitare ed osservare selettivamente il loro fluorophore, anche nello stesso ambiente di altre proteine triptofano-contenenti. Per esempio, 5-OH-Trp è stato usato per creare un analogo dell'insulina per gli studi sulle interazioni del recettore ormonale.

Applicazioni del DNA della spettroscopia del tempo risolta di fluorescenza

La fluorescenza intrinseca del DNA è solitamente molto debole, che piombo alle tinture che sono usando come contrassegni. Gli avanzamenti in materia hanno veduto le sonde fluorescenti che si sono aggiunte e la spettroscopia del tempo risolta della fluorescenza si è trasformata in in un metodo sempre più importante nello studio dei complessi della DNA-proteina e del DNA. Per esempio, DAPI, un raccoglitore della scanalatura, è stato usato mentre una sonda per studiare i moti del DNA facendo uso dell'anisotropia si decompone i metodi.

I metodi intrinsechi della fluorescenza egualmente sono stati usati, come quelli che utilizzano le basi delle timine. Gli studi facendo uso delle basi delle timine su oligonucleotidi a doppia elica e su polinucleotidi hanno indicato i movimenti del DNA con grande ampiezza ai tempi di correlazione di sotto-nanosecondo.

Gli studi sui complessi della DNA-proteina possono usare l'emissione del triptofano della proteina o la vita fluorescente delle sonde del DNA. Per esempio, facendo uso dell'emissione del triptofano da TBP, è stato indicato che TBP trasforma da un multimer ad un complesso monomerico sopra l'associazione del DNA. Facendo uso di fluorescina una sonda ha aggiunto a DNA, i punti di contatto fra la proteina regolatrice di TyrR ed il DNA potrebbe essere trovato.

Vantaggi e svantaggi

la spettroscopia Del tempo risolta della fluorescenza presenta parecchi vantaggi relativi ai sui metodi. I metodi di misura dipendono dalla vita della fluorescenza e poichè tale non è influenzato generalmente tramite le differenze nella concentrazione di fluorophores, l'intensità dell'illuminazione, la lunghezza di percorso dell'indicatore luminoso, o di photobleaching, che può pregiudicare altri tipi di spettroscopie della fluorescenza.

Ancora, i dati acquistati significano che l'ambiente locale del fluorophore può direttamente essere misurato quantitativamente. Ciò significa che i dati sulla viscosità dell'ambiente, sull'indice di rifrazione, sul pH e su altri parametri possono essere misurati senza l'esigenza delle analisi biochimiche che compromettono la cella.

Gli svantaggi della spettroscopia del tempo risolta della fluorescenza sono collegati spesso con l'analisi dei dati. Per uno, le proteine fluorescenti hanno complicato spesso fluorescente si decompone, che necessita determinata competenza per l'interpretazione di dati. Similmente, se la vita della fluorescenza subisce i cambiamenti specifici, le ragioni biochimiche non possono essere facilmente distinguibili senza parere di un esperto. Infine, la strumentazione stata necessaria per la spettroscopia del tempo risolta della fluorescenza è complessa e costosa.

Sorgenti

  1. Suhling, K. et al. (2005). microscopia di fluorescenza Del tempo risolta. Scienze fotochimiche e fotobiologiche. https://doi.org/10.1039/B412924P
  2. Millar, D.P. (1996). spettroscopia Del tempo risolta di fluorescenza. Opinione corrente nella biologia strutturale. https://doi.org/10.1016/S0959-440X(96)80030-3

Last Updated: Jan 17, 2020

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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