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¿Cuál es espectroscopia Tiempo-Resuelta de la fluorescencia?

la espectroscopia Tiempo-resuelta de la fluorescencia es una técnica de la espectroscopia usada para vigilar acciones recíprocas entre las moléculas y los movimientos que ocurren en los períodos cortos. La capacidad de medir cambios en el alcance de tiempo del picosegundo o del nanosegundo le hace una técnica útil en análisis y dinámica biomoleculares de estructura.

Neuronas marcadas con fluorescencia

Haber de imagen: Juan Gaertner/Shutterstock.com

Los fundamentos de la espectroscopia tiempo-resuelta de la fluorescencia

la espectroscopia Tiempo-resuelta de la fluorescencia puede descubrir acciones dentro de un ambiente fluoróforo. Las acciones que pueden ser medidas son extinción, indicada por una disminución de la fluorescencia después de la excitación, y la extinción de la anisotropía de la polarización, donde la reorientación del dipolo de la emisión durante la excitación se mide.

Trabajos tiempo-resueltos medidos de la espectroscopia de la fluorescencia de la extinción basados en la duración del estado emocionado, que se puede acortar por ciertas acciones dinámicas incluyendo cambios macromoleculares de la conformación, la relajación solvente, la rotación de la cadena lateral, acciones recíprocas entre los residuos vecinos, y otros cambios en el ambiente local. La variación es solamente de algunos picosegundos o los diez de nanosegundos, significando cambios mensurables deben ocurrir dentro de este alcance de tiempo. Los progresos en este tipo de medición están permitiendo entender la información estructural, por ejemplo discerniendo distancias entre las antenas.

La espectroscopia tiempo-resuelta de la fluorescencia de la extinción de la anisotropía de la polarización se puede utilizar para entender el movimiento de la movilidad fluorófora, segmentaria, o la rotación de una macromolécula entera. Esto permite al método medir datos sobre la hidrodinámica, que es la difusión rotatoria de proteínas o de ácidos nucléicos. Debido al alcance de la detección del picosegundo de la espectroscopia tiempo-resuelta de la fluorescencia, puede también ser utilizada para medir la dinámica interna de las macromoléculas que pueden potencialmente confirmar predicciones teóricas de dinámicas moleculares.

Usos de la proteína de la espectroscopia tiempo-resuelta de la fluorescencia

Dependiendo de la macromolécula en foco, el método y el uso cambian ligeramente. Al estudiar las proteínas, la extinción de fluorescencia se mide que es lo más a menudo posible de residuos del triptófano. Los datos han mostrado que la extinción de fluorescencia del triptófano es sensible al ambiente local, que le hace una antena muy útil para los estudios en la estructura y dinámicas de la proteína. Además, dado que muchas proteínas tienen solamente un residuo del triptófano, la desventaja de la interpretación complicada de los datos puede ser evitada.

Mientras que el triptófano es la antena favorecida para los estudios en la estructura de la proteína y dinámica, no es muy útil para los estudios de la acción recíproca de la proteína-proteína debido a las señales enrolladas de la fluorescencia cuando dos o más proteínas son mezcladas. Las opciones en estos casos son el azatryptophan 5 el hydroxytryptophan (5-OH-Trp) y 7 (7-aza-Trp). Éstos son útil debido a su capacidad de excitar y de observar selectivamente su fluoróforo, incluso en el mismo ambiente que otras proteínas triptófano-que contienen. Por ejemplo, 5-OH-Trp se ha utilizado para crear un análogo de la insulina para los estudios en acciones recíprocas del hormona-receptor.

Usos de la DNA de la espectroscopia tiempo-resuelta de la fluorescencia

La fluorescencia intrínseca de la DNA es generalmente muy débil, que ha llevado a los tintes que eran utilizados como escrituras de la etiqueta. Los avances en este campo han considerado las antenas fluorescentes que eran agregadas, y la espectroscopia tiempo-resuelta de la fluorescencia se ha convertido en un método cada vez más importante en estudiar complejos de la DNA y de la DNA-proteína. Por ejemplo, se ha utilizado DAPI, un aglutinante de la ranura, mientras que una antena para estudiar movimientos de la DNA usando anisotropía decae métodos.

Los métodos intrínsecos de la fluorescencia también se han utilizado, por ejemplo los que utilizan bases del thymine. Los estudios usando bases del thymine en oligonucleótidos y polinucleótidos doble-trenzados han indicado movimientos de la DNA con amplitud grande en los tiempos de la correlación del sub-nanosegundo.

Los estudios de los complejos de la DNA-proteína pueden utilizar la emisión del triptófano de la proteína o el curso de la vida fluorescente de las antenas de la DNA. Por ejemplo, usando la emisión del triptófano de TBP, fue mostrado que TBP transforma de un multimer a un complejo monomérico sobre el atascamiento de la DNA. Usando la fluoresceína una antena agregó a la DNA, los puntos del contacto entre la proteína reguladora de TyrR y la DNA podría ser encontrada.

Ventajas y desventajas

la espectroscopia Tiempo-resuelta de la fluorescencia tiene varias ventajas relacionadas con sus métodos. Los métodos de la medición dependen del curso de la vida de la fluorescencia, y pues tal no es afectado generalmente por diferencias en la concentración de fluorophores, intensidad de la iluminación, la longitud del camino de la luz, o de photobleaching, que puede afectar a otros tipos de espectroscopia de la fluorescencia.

Además, los datos detectados significan que el ambiente local del fluoróforo puede ser medido directamente cuantitativo. Esto significa que los datos sobre la viscosidad del ambiente, el índice de refracción, el pH, y otros parámetros se pueden medir sin la necesidad de los análisis bioquímicos que comprometen la célula.

Las desventajas de la espectroscopia tiempo-resuelta de la fluorescencia se relacionan a menudo con el análisis de los datos. Para uno, las proteínas fluorescentes han complicado a menudo fluorescente decaen, que necesita cierta experiencia para la interpretación de los datos. Semejantemente, si el curso de la vida de la fluorescencia experimenta cambios específicos, las razones bioquímicas pueden no ser fácilmente perceptibles sin asesoramiento de experto. Pasado, el equipo necesario para la espectroscopia tiempo-resuelta de la fluorescencia es complejo y costoso.

Fuentes

  1. Suhling, K. y otros (2005). microscopia de fluorescencia Tiempo-resuelta. Ciencias fotoquímicas y fotobiológicas. https://doi.org/10.1039/B412924P
  2. Millar, D.P. (1996). espectroscopia Tiempo-resuelta de la fluorescencia. Opinión actual en biología estructural. https://doi.org/10.1016/S0959-440X(96)80030-3

Last Updated: Jan 17, 2020

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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