Che cosa è il Interactome?

Una rete del interactome si riferisce a tutte le interazioni della proteina-proteina che hanno luogo dentro una cella. Tali mappe del interactome sono state create per lievito, i vermi, mosche e stanno cominciando ad essere create per gli esseri umani.

In lievito, la dimensione del interactome è stimata per essere circa 28.000 interazioni della proteina-proteina, mentre il numero delle interazioni in esseri umani è stimato per essere intorno 650.000.

I metodi differenti impiegati per mappare ed analizzare il interactome sono discussi qui sotto.

Spettroscopia di correlazione incrociata di fluorescenza

La spettroscopia di correlazione della fluorescenza o il FCS misura le fluttuazioni termodinamiche nell'intensità della fluorescenza delle proteine etichettate. Facendo uso del microscopio confocale, la dinamica di come le molecole di proteina fluorescente-etichettate muovono comunque un piccolo volume focale è quantificata. I beni della diffusione delle proteine etichettate dipendono dalla loro concentrazione ed interazioni con altre molecole. Nella microscopia di correlazione trasversale della fluorescenza, due proteine fluorescente contrassegnate sono visualizzate. Se queste proteine sono associate a vicenda, si muovono in un modo sincronizzato. Ciò piombo col passare del tempo alle simili fluttuazioni nei loro segnali fluorescenti. Quindi, FCCS quantitativo può misurare le interazioni della proteina-proteina per generare le mappe quantitative del interactome.

Metodi bimolecolari di complementazione

analisi di complementazione della Proteina-proteina (PCA)

Questo metodo egualmente è usato per studiare le interazioni della proteina-proteina. In questo metodo, una proteina fluorescente è spaccata dentro a due e poi è fusa né ai C-terminali di due proteine d'interazione potenziali. Se le proteine interagiscono, le due unità si combinano, piombo alla fluorescenza che può poi essere visualizzata.

BiFC

Questo metodo è una variante di APC dove GFP è diviso in due parti ed è fuso ai peptidi potenzialmente d'interazione. L'interazione dei peptidi piombo al montaggio delle molecole funzionali di GFP che poi sono flourescenti.

BiLC

Ciò è un'altra variante di APC dove, invece delle proteine fluorescenti, il luciferase è usato. Il luciferase è spezzettato ancora in due per prevedere le interazioni. I beni importanti di questo metodo sono che l'associazione dei frammenti di luciferase è irreversibile. Quindi, questo metodo può essere usato per studiare sia l'interazione che la dissociazione delle proteine dentro una cella.

A metodi Basati a cerchio

Il CERCHIO o il trasferimento di risonanza di energia di Forster è un metodo basato sopra la distanza fra due fluorophores. In questo metodo, se individuata abbastanza vicino, una molecola fluorophore emozionante (donatore) trasferisce la sua energia ad un'altra molecola fluorophore (ricettore). Ciò piombo ad un'emissione della fluorescenza nella molecola del ricettore. Le misure delle lunghezze d'onda dell'emissione e di eccitazione possono essere usate per misurare le interazioni fra due molecole mentre il CERCHIO può accadere soltanto quando il donatore o le molecole del ricettore è molto nella grande prossimità o nell'interazione diretta a vicenda. La limitazione di questo metodo è quella che studia l'interazione della proteina-proteina per formare una mappa del interactome richiede l'etichettatura delle proteine di interesse con i fluorophores appropriati del donatore e del ricettore. Ciò richiede la creazione delle proteine genetiche di fusione.

A metodi Basati BRET

BRET o a trasferimento di energia basato a bioluminescenza di risonanza comprende l'ossidazione di substrato dall'enzima di luciferase. Il substrato ossidato poi emette l'indicatore luminoso a 395 nanometro che è catturato da una molecola del ricettore GFP che piombo alla fluorescenza di GFP. Poichè non c'è esigenza della sorgente luminosa esterna in BRET, c'è meno rumore di fondo, autoflourescence e scattering leggero.  

A metodi Basati Luciferase di Co-Immunoprecipitazione

Questo metodo egualmente è usato per individuare le interazioni della proteina-proteina per generare la mappa del interactome. Questo metodo è meno laborioso e che richiede tempo che i metodi convenzionali di co-immunoprecipitazione. In questo metodo, le proteine del donatore e del ricettore sono fuse con il FLAG e le costruzioni di Renilla. Tutte le interazioni o associazioni possono essere individuate facendo uso dell'analisi enzimatica di luciferase.

Facendo uso di questo metodo, tantissimi partner del donatore/ricettore o di interazione possono essere individuati. Ciò è contrariamente ai metodi convenzionali di co-immunoprecipitazione dove soltanto una singola interazione può essere risoluta. Questo vantaggio è critico mentre costruisce le mappe del interactome che comprendono migliaia di interazioni. Tuttavia, uno svantaggio di questo metodo è che la proteina Flag-etichettata non può essere quantificata che può generare i risultati del falso negativo.

Analisi di legatura di prossimità

In questo metodo, gli anticorpi sono fissati ai brevi oligonucleotidi unico incagliati del DNA o alle sonde di PLA. Questi anticorpi poi legano a proteina dentro le celle. La prossimità o l'interazione di due proteine può piombo alla legatura delle molecole del DNA che possono poi essere ampliate facendo uso di una reazione a catena della polimerasi. Le sonde fluorescenti poi legano a queste regioni ampliate del DNA che poi funge da indicatore per mostrare le proteine d'interazione.

Quindi, i metodi differenti possono essere usati per mappare le interazioni in una cella che poi sono usate per formare il interactome.

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Last Updated: Aug 24, 2018

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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