Que é o Interactome?

Uma rede do interactome refere todas as interacções da proteína-proteína que ocorrem dentro de uma pilha. Tais mapas do interactome foram criados para o fermento, sem-fins, moscas, e estão começando a ser criados para seres humanos.

No fermento, o tamanho do interactome está calculado para ser aproximadamente 28.000 interacções da proteína-proteína, quando o número de interacções nos seres humanos for calculado para ser ao redor 650.000.

Os métodos diferentes usados para traçar e analisar o interactome são discutidos abaixo.

Espectroscopia da correlação cruzada da fluorescência

A espectroscopia da correlação da fluorescência ou o FCS medem as flutuações termodinâmicas na intensidade da fluorescência de proteínas etiquetadas. Usando o microscópio confocal, a dinâmica de como as moléculas de proteína fluorescente-etiquetadas movem embora um volume focal pequeno é determinada. As propriedades da difusão das proteínas etiquetadas dependem de suas concentração e interacções com outras moléculas. Na microscopia da correlação transversal da fluorescência, duas proteínas fluorescente etiquetadas são visualizadas. Se estas proteínas são associadas um com o otro, movem-se em uma maneira sincronizada. Isto conduz às flutuações similares em seus sinais fluorescentes ao longo do tempo. Assim, FCCS quantitativo pode medir interacções da proteína-proteína para gerar mapas quantitativos do interactome.

Métodos bimoleculares da complementação

ensaio da complementação da Proteína-proteína (PCA)

Este método é usado igualmente para estudar interacções da proteína-proteína. Neste método, uma proteína fluorescente é separação dentro a dois, e fundido então ao nem aos C-terminais de duas proteínas de interacção potenciais. Se as proteínas interagem, as duas unidades combinam, conduzindo à fluorescência que pode então ser visualizada.

BiFC

Este método é uma variação do APC onde GFP é separação em duas porções e fundida aos peptides potencial de interacção. A interacção dos peptides conduz ao conjunto das moléculas funcionais de GFP que brilham então.

BiLC

Esta é uma outra variação do APC onde, em vez das proteínas fluorescentes, o luciferase é usado. O luciferase é fragmentado outra vez em dois para visualizar interacções. Uma propriedade importante deste método é que a associação dos fragmentos do luciferase é irreversível. Assim, este método pode ser usado para estudar a interacção e a dissociação das proteínas dentro de uma pilha.

Métodos Fricção-Baseados

A FRICÇÃO ou transferência de ressonância da energia de Forster são um método baseado na distância entre dois fluorophores. Neste método, se encontrada perto bastante, uma molécula fluorófora entusiasmado (doador) transfere sua energia a uma outra molécula fluorófora (autómato). Isto conduz a uma emissão da fluorescência na molécula do autómato. As medidas dos comprimentos de onda da excitação e da emissão podem ser usadas para medir interacções entre duas moléculas enquanto a FRICÇÃO pode ocorrer somente quando o doador ou as moléculas do autómato estão muito na grande proximidade ou na interacção directa um com o otro. A limitação deste método é aquela que estuda a interacção da proteína-proteína para formar um mapa do interactome exige a colocação de etiquetas das proteínas do interesse com os fluorophores apropriados do autómato e do doador. Isto exige a criação de proteínas genéticas da fusão.

Métodos BRET-Baseados

BRET ou transferência de energia bioluminescência-baseada da ressonância envolvem a oxidação de uma carcaça pela enzima do luciferase. A carcaça oxidada emite-se então a luz em 395 nanômetro que é capturada por uma molécula do autómato GFP que conduz à fluorescência de GFP. Porque não há nenhuma necessidade para a fonte luminosa externo em BRET, há menos ruído de fundo, autoflourescence, e dispersão de luz.  

Métodos Luciferase-Baseados da Co-Imunoprecipitação

Este método é usado igualmente para detectar interacções da proteína-proteína para gerar o mapa do interactome. Este método é menos laborioso e demorado do que os métodos convencionais da co-imunoprecipitação. Neste método, as proteínas do autómato e do doador são fundidas com BANDEIRA e construções de Renilla. Todas as interacções ou associações podem ser detectadas usar o ensaio enzimático do luciferase.

Usando este método, um grande número sócios do doador/autómato ou da interacção podem ser detectados. Isto é em contraste com os métodos convencionais da co-imunoprecipitação onde somente uma única interacção pode ser determinada. Esta vantagem é crítica ao construir os mapas do interactome que envolvem milhares de interacções. Contudo, uma desvantagem deste método é que a proteína Bandeira-etiquetada não pode ser determinada que pode gerar resultados do negativo falso.

Ensaios da ligadura da proximidade

Neste método, os anticorpos são anexados aos oligonucleotides único-encalhados curtos do ADN ou às pontas de prova do PLA. Estes anticorpos ligam então à proteína dentro das pilhas. A proximidade ou a interacção de duas proteínas podem conduzir à ligadura das moléculas do ADN que podem então ser amplificadas usando uma reacção em cadeia da polimerase. As pontas de prova fluorescentes ligam então a estas regiões amplificadas do ADN que actua então como um marcador para mostrar proteínas de interacção.

Assim, os métodos diferentes podem ser usados para traçar as interacções em uma pilha que são usadas então para formar o interactome.

Fontes:

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Last Updated: Aug 24, 2018

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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