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Pourquoi la Bêta-Actine et les GADPH sont-ils employés comme contrôles dans le Western blotting ?

Le Western blotting est une technique biologique employée pour trouver les protéines spécifiques dans un échantillon. Il est important d'employer des contrôles de ménage quand exécuter ce test ainsi la protéine d'intérêt peut être comparé à une protéine connue.

Cellules pour lDesign_cells | Shutterstock

Western blotting

Dans éponger occidental, les protéines sont séparées par leur longueur ou structure 3D utilisant l'électrophorèse en gel. Les protéines sont alors transférées à une membrane où elles sont sondées utilisant des anticorps spécifiques à la protéine cible.

Préparation de l'échantillon

La première étape d'éponger occidental est de préparer l'échantillon. Pour préparer l'échantillon pour un gel, les cellules ou des tissus sont lysés pour relâcher les protéines d'intérêt. La cellule ou les tissus sont mis avec un détergent qui extrait les protéines solubles. Après quelques ronds de centrifugation, les protéines sont gagnées dans un surnageant.

SDS-PAGE

La prochaine opération concerne séparer les protéines basées sur leur poids moléculaire utilisant l'électrophorèse en gel dodécylique de sulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE). Avant SDS-PAGE exécutant, la concentration protéique doit être mesurée. Les protéines sont alors dénaturées utilisant le sulfate dodécylique de sodium (SDS) qui expose l'épitope sur la protéine d'intérêt. Les voies sont chargées avec la protéine, et la première voie se compose d'une borne. L'élément d'électrophorèse est rempli de tampon et commencé.

Transfert de protéine

La prochaine opération concerne transférer la protéine à partir du gel sur la membrane utilisant le transfert mouillé de `'. Ceci concerne serrer le gel et la membrane entre l'éponge et le papier et puis la submerger dans un tampon de transfert. Un champ électrique est alors appliqué pour forcer les protéines négatif-chargées sur la membrane.

Incubation et dépistage d'anticorps

D'abord, la membrane doit être bloquée utilisant une solution de blocage pour éviter le grippement de mouvement propre. Après ceci, on ajoute l'anticorps primaire qui grippe à l'épitope de la protéine d'intérêt. La membrane est incubée pendant environ une heure pour que l'anticorps primaire grippe. L'anticorps secondaire est puis ajouté, incubé, et trouvé pour indiquer la protéine d'intérêt.

Pourquoi est-ce que des contrôles sont nécessaires ?

Bêta-actine et GADPH comme contrôles

La protéine de contrôle utilisée dans éponger occidental doit être présente en travers de tous les types de cellules ou de types de tissu qui sont employés dans l'expérience. L'expression de la protéine de contrôle ne devrait pas changer en raison de la méthode expérimentale et la protéine d'intérêt et la protéine de contrôle devraient être dans la portée de détection.

Les deux contrôles les plus utilisés généralement sont bêta-actine et le phosphate-déshydrogénase de la glycéraldéhyde 3 (GADPH). la Bêta-actine est utilisée généralement car un contrôle de charge occidental de tache comme est exprimé dans tous les types de cellule eucaryote et n'est pas affecté par des demandes de règlement cellulaires.

la Bêta-actine est approximativement 42 kDa et GADPH est approximativement 36 kDa. Ils sont employés pendant qu'un contrôle pendant qu'ils restent stables en présence d'un large éventail de composés.

Considérations en employant des contrôles de protéine

Les études récentes ont découvert que les protéines de ménage, telles que GADPH et bêta-actine, peuvent être modifiées par les conditions expérimentales et biaiser les résultats. Par conséquent, n'importe quelle protéine qui est sélectée comme contrôle de standardisation doit être validée en ce qui concerne le type et les conditions expérimentales d'échantillon.

Une autre étude (réalisée par Rocha-Martins, et autres) a prouvé que beaucoup de chercheurs emploient les protéines courantes de ménage sans validation, qui peut mener aux résultats décentrés d'étude.

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Last Updated: Jan 14, 2019

Written by

Samuel Mckenzie

Sam graduated from the University of Manchester with a B.Sc. (Hons) in Biomedical Sciences. He has experience in a wide range of life science topics, including; Biochemistry, Molecular Biology, Anatomy and Physiology, Developmental Biology, Cell Biology, Immunology, Neurology  and  Genetics.

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