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Perché l'Beta-Actina e GADPH utilizzati come comandi in occidentale stanno macchiando?

Macchiare occidentale è una tecnica biologica usata per individuare le proteine specifiche all'interno di un campione. È importante usare i comandi del governo della casa quando eseguire questa prova in modo dalla proteina di interesse può essere confrontata ad una proteina conosciuta.

Celle per analisi facendo uso del macchiare occidentale - da Design_CellsDesign_cells | Shutterstock

Macchiare occidentale

Nel macchiare occidentale, le proteine sono separate dalla loro lunghezza o struttura 3D facendo uso dell'elettroforesi del gel. Le proteine poi sono trasferite ad una membrana in cui sono sondate facendo uso degli anticorpi specifici alla proteina bersaglio.

Preparazione del campione

Il primo punto di macchiare occidentale è di preparare il campione. Per preparare il campione per un gel, le celle o i tessuti sono fatti l'elettrolisi per rilasciare le proteine di interesse. La cella o i tessuti è collocato con un detersivo che estrae le proteine solubili. Dopo alcuni giri di centrifugazione, le proteine sono guadagnate in un galleggiante.

SDS-PAGE

Il punto seguente comprende separare le proteine basate sul loro peso molecolare facendo uso dell'elettroforesi dodecilica del gel del solfato-poliacrilammide del sodio (SDS-PAGE). Prima di SDS-PAGE d'esecuzione, la concentrazione nella proteina deve essere misurata. Le proteine poi sono denaturate facendo uso del solfato dodecilico di sodio (SDS) che espone l'epitopo sulla proteina di interesse. Le corsie sono caricate con la proteina e la prima corsia consiste di un indicatore. L'unità dell'elettroforesi è riempita di buffer ed è iniziata.

Trasferimento della proteina

Il punto seguente comprende trasferire la proteina dal gel sulla membrana facendo uso del passaggio per via d'acqua del `'. Ciò comprende interporre il gel e la membrana fra la spugna ed il documento e poi sommergerla in un buffer di trasferimento. Un campo elettrico poi si applica per forzare le proteine caricate negativamente sulla membrana.

Incubazione e rilevazione dell'anticorpo

In primo luogo, la membrana deve essere bloccata facendo uso di una soluzione di didascalia per impedire l'associazione di sfondo. Dopo questo, l'anticorpo primario si aggiunge che lega all'epitopo della proteina di interesse. La membrana è incubata per approssimativamente un'ora affinchè l'anticorpo primario leghi. L'anticorpo secondario poi si aggiunge, incubato ed è individuato per rivelare la proteina di interesse.

Perché i comandi sono necessari?

Beta-actina e GADPH come comandi

La proteina di controllo utilizzata nel macchiare occidentale deve essere presente attraverso tutti i tipi delle cellule o i tipi del tessuto che sono utilizzati nell'esperimento. L'espressione della proteina di controllo non dovrebbe cambiare dovuto la procedura sperimentale e sia la proteina di interesse che la proteina di controllo dovrebbero essere all'interno dell'intervallo di rilevazione.

I due comandi più comunemente usati sono beta-actina e deidrogenasi di fosfato della gliceraldeide 3 (GADPH). l'Beta-actina è comunemente usata poichè un controllo di caricamento occidentale della macchia come è espresso all'interno di tutti i tipi eucariotici delle cellule e non è influenzato dai trattamenti cellulari.

l'Beta-actina è kDa circa 42 e GADPH è kDa circa 36. Sono usati mentre un controllo mentre rimangono stabili in presenza di una vasta gamma di composti.

Considerazioni quando usando i comandi della proteina

Gli studi recenti hanno scoperto che le proteine del governo della casa, quali GADPH e beta-actina, possono essere alterate dalle circostanze sperimentali e distorcere i risultati. Di conseguenza, tutta la proteina che è selezionata come controllo di normalizzazione deve essere convalidata riguardo al tipo del campione ed alle circostanze sperimentali.

Un altro studio (svolto da Rocha-Martins, et al.) ha indicato che molti ricercatori usano le proteine comuni del governo della casa senza convalida, che può piombo ai risultati polarizzati di studio.

Sorgenti

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Last Updated: Jan 14, 2019

Written by

Samuel Mckenzie

Sam graduated from the University of Manchester with a B.Sc. (Hons) in Biomedical Sciences. He has experience in a wide range of life science topics, including; Biochemistry, Molecular Biology, Anatomy and Physiology, Developmental Biology, Cell Biology, Immunology, Neurology  and  Genetics.

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