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Por que o Beta-Actínio e GADPH usados como controles em ocidental estão borrando?

A mancha ocidental é uma técnica biológica usada para detectar proteínas específicas dentro de uma amostra. É importante usar controles das tarefas domésticas quando executar este teste assim que a proteína do interesse pode ser comparada a uma proteína conhecida.

Pilhas para a análise usando a mancha ocidental - por Design_CellsDesign_cells | Shutterstock

Mancha ocidental

Na mancha ocidental, as proteínas são separadas por sua comprimento ou estrutura 3D usando a electroforese do gel. As proteínas são transferidas então a uma membrana onde sejam sondadas usando os anticorpos específicos à proteína do alvo.

Preparando a amostra

A primeira etapa da mancha ocidental é preparar a amostra. Para preparar a amostra para um gel, as pilhas ou os tecidos lysed para liberar as proteínas do interesse. A pilha ou os tecidos são colocados com um detergente que extraia proteínas solúveis. Após alguns círculos da centrifugação, as proteínas são ganhadas em um supernatant.

SDS-PAGE

O passo seguinte envolve separar as proteínas baseadas em seu peso molecular usando a electroforese dodecyl do gel do sulfato-polyacrylamide do sódio (SDS-PAGE). Antes de SDS-PAGE de execução, a concentração da proteína precisa de ser medida. As proteínas são desnaturadas então usando o sulfato dodecyl de sódio (SDS) que expor o resumo na proteína do interesse. As pistas são carregadas com a proteína, e a primeira pista consiste em um marcador. A unidade da electroforese é enchida com o amortecedor e começada.

Transferência da proteína

O passo seguinte envolve transferir a proteína do gel na membrana usando transferência molhada do `'. Isto envolve imprensar o gel e a membrana entre a esponja e o papel e então submergi-la em um amortecedor de transferência. Um campo elétrico é aplicado então para forçar as proteínas negativo-cobradas na membrana.

Incubação e detecção do anticorpo

Primeiramente, a membrana precisa de ser obstruída usando uma solução de obstrução para impedir o emperramento do fundo. Após isto, o anticorpo preliminar é adicionado que liga ao resumo da proteína do interesse. A membrana é incubada por aproximadamente uma hora para que o anticorpo preliminar ligue. O anticorpo secundário então é adicionado, incubado, e detectado para revelar a proteína do interesse.

Por que são os controles necessários?

Beta-actínio e GADPH como controles

A proteína do controle usada na mancha ocidental deve esta presente através de todos os tipos da pilha ou de tipos do tecido que são usados na experiência. A expressão da proteína do controle não deve mudar devido ao procedimento experimental e a proteína do interesse e a proteína do controle devem estar dentro da escala de detecção.

Os dois controles os mais de uso geral são beta-actínio e de fosfato do Glyceraldehyde 3 a desidrogenase (GADPH). o Beta-actínio é de uso geral porque um controle de carga ocidental da mancha como é expressado dentro de todos os tipos eucarióticas da pilha e não afectado por tratamentos celulares.

o Beta-actínio é o kDa aproximadamente 42 e GADPH é o kDa aproximadamente 36. Estão usados enquanto um controle enquanto permanecem estáveis na presença de uma vasta gama de compostos.

Considerações ao usar controles da proteína

Os estudos recentes descobriram que as proteínas das tarefas domésticas, tais como GADPH e beta-actínio, podem ser alteradas pelas circunstâncias experimentais e enviesar os resultados. Conseqüentemente, toda a proteína que for seleccionada como um controle da normalização deve ser validada no que diz respeito ao tipo da amostra e às circunstâncias experimentais.

Um outro estudo (executado por Rocha-Martins, e outros) mostrou que muitos pesquisadores usam proteínas comuns das tarefas domésticas sem validação, que pode conduzir aos resultados inclinados do estudo.

Fontes

Further Reading

Last Updated: Jan 14, 2019

Written by

Samuel Mckenzie

Sam graduated from the University of Manchester with a B.Sc. (Hons) in Biomedical Sciences. He has experience in a wide range of life science topics, including; Biochemistry, Molecular Biology, Anatomy and Physiology, Developmental Biology, Cell Biology, Immunology, Neurology  and  Genetics.

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