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¿Por qué la Beta-Actinia y GADPH usados como mandos en occidental están borrando?

El borrar occidental es una técnica biológica usada para descubrir las proteínas específicas dentro de una muestra. Es importante utilizar mandos del aseo cuando la ejecución de esta prueba así que de la proteína del interés se puede comparar a una proteína sabida.

Células para el análisis usando borrar occidental - por Design_CellsDesign_cells | Shutterstock

El borrar occidental

En borrar occidental, las proteínas son separadas por su largo o estructura 3D usando electroforesis del gel. Las proteínas entonces se transfieren a una membrana donde se sondan usando los anticuerpos específicos a la proteína del objetivo.

Preparación de la muestra

El primer paso de borrar occidental es preparar la muestra. Para preparar la muestra para un gel, las células o los tejidos lysed para liberar las proteínas del interés. La célula o los tejidos se coloca con un detersorio que extraiga las proteínas solubles. Después de algunos cartuchos de la centrifugación, las proteínas se ganan en un sobrenadante.

SDS-PAGE

El paso siguiente implica el separar de las proteínas basadas en su peso molecular usando la electroforesis dodecyl del gel de la sulfato-poliacrilamida del sodio (SDS-PAGE). Antes de SDS-PAGE de ejecución, la concentración de la proteína necesita ser medida. Las proteínas entonces se desnaturalizan usando el sulfato dodecyl de sodio (SDS) que expone el epitopo en la proteína del interés. Las sendas se cargan con la proteína, y la primera senda consiste en un marcador. La unidad de la electroforesis se llena del almacenador intermedio y se comienza.

Transferencia de la proteína

El paso siguiente implica el transferir de la proteína del gel sobre la membrana usando transferencia mojada del `'. Esto implica el intercalar del gel y de la membrana entre la esponja y el papel y después el sumergir de ella en un almacenador intermedio de la transferencia. Un campo eléctrico entonces se aplica para forzar las proteínas negativo-cargadas sobre la membrana.

Incubación y detección del anticuerpo

Primero, la membrana necesita ser cegada usando una solución que ciega para prevenir el atascamiento del fondo. Después de esto, se agrega el anticuerpo primario que ata al epitopo de la proteína del interés. La membrana se incuba por aproximadamente una hora para que el anticuerpo primario ate. El anticuerpo secundario después se agrega, se incuba, y se descubre para revelar la proteína del interés.

¿Por qué se necesitan los mandos?

Beta-actinia y GADPH como mandos

La proteína del mando usada en borrar occidental debe estar presente a través de todos los tipos de la célula o de los tipos del tejido que se utilicen en el experimento. La expresión de la proteína del mando no debe cambiar debido al procedimiento experimental y la proteína del interés y la proteína del mando deben estar dentro del alcance de la detección.

Los dos mandos más de uso general son beta-actinia y la deshidrogenasa de fosfato del gliceraldehído 3 (GADPH). la Beta-actinia es de uso general pues un mando de cargamento occidental de la mancha blanca /negra como se expresa dentro de todos los tipos eucarióticos de la célula y no es afectado por tratamientos celulares.

la Beta-actinia es el kDa aproximadamente 42 y GADPH es el kDa aproximadamente 36. Se utilizan mientras que un mando mientras que siguen siendo estables en presencia de una amplia gama de composiciones.

Consideraciones al usar mandos de la proteína

Los estudios recientes han descubierto que las proteínas del aseo, tales como GADPH y beta-actinia, pueden ser alteradas por las condiciones experimentales y sesgar los resultados. Por lo tanto, cualquier proteína que se seleccione como mando de la normalización se debe validar en cuanto al tipo de la muestra y a las condiciones experimentales.

Otro estudio (realizado por Rocha-Martins, y otros) mostró que muchos investigadores utilizan las proteínas comunes del aseo sin la validación, que puede llevar a los resultados en polarización negativa del estudio.

Fuentes

Further Reading

Last Updated: Jan 14, 2019

Written by

Samuel Mckenzie

Sam graduated from the University of Manchester with a B.Sc. (Hons) in Biomedical Sciences. He has experience in a wide range of life science topics, including; Biochemistry, Molecular Biology, Anatomy and Physiology, Developmental Biology, Cell Biology, Immunology, Neurology  and  Genetics.

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