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microscopie à fluorescence de Large-inducteur

la microscopie à fluorescence de Large-inducteur est une technique d'imagerie largement appliquée employée pour examiner des cellules et pour vérifier leurs structures internes, y compris des protéines et d'autres éléments cellulaires.

Par VshivkovaCrédit d'image : Vshivkova/Shutterstock

Dans cette technique, l'échantillon entier est illuminé et une 2D image des protéines multiples peut être recensée immédiatement.

Quels sont des fluorophores ?

Fluorophores sont excités sur l'absorption d'une longueur d'onde spécifique de la lumière, ayant pour résultat le mouvement des électrons à un niveau énergétique plus élevé. Ces électrons tombent alors à leur condition originelle, menant à la production d'une plus longue longueur d'onde. La longueur d'onde absorbée est appelée la longueur d'onde d'excitation, alors que la longueur d'onde émise est appelée la longueur d'onde d'émission.

Charge la commande des vitesses définit la différence entre ces valeurs. Chacun fluorophore peut émettre et absorber les différentes longueurs d'onde, qui sont connues en tant que leurs spectres d'excitation et d'émission. Ces gammes mettent en boîte utilisé pour définir différents types de fluorophore.

Préparation des échantillons

Quelques échantillons biologiques contiennent naturellement des fluorophores (par exemple chlorophylle). Alternativement, des échantillons biologiques peuvent être marqués suivre différentes méthodes, y compris l'immunofluorescence, la manipulation d'ADN, ou les souillures fluorescentes. L'immunofluorescence emploie les anticorps fluorophore-branchés, qui identifient un antigène spécifique et marquent pour cette raison la protéine d'intérêt.

La manipulation d'ADN, cependant, modifie génétiquement la protéine d'intérêt de la rendre fluorescente. Des souillures peuvent également être ajoutées à un échantillon qui grippe particulièrement à la protéine d'intérêt. Par exemple, DAPI est une souillure d'acide nucléique qui recense des noyaux en grippant à l'ADN.

Méthodologie

Un voyant émet la lumière d'excitation qui traverse un filtre optique qui s'assure que seulement les longueurs d'onde spécifiques d'excitation tombent sur l'échantillon. La lumière est alors visée l'échantillon par l'intermédiaire de la réflexion hors d'un miroir dichroïque.

Les fluorophores enthousiastes dans l'échantillon émettent une longueur d'onde d'émission plus élevée qui est trouvée par un appareil-photo. Cette caractéristique est alors mesurée et employée pour recenser l'emplacement spécifique des protéines dans l'échantillon.

La source lumineuse

Mercury ou les arc-voyants de xénon sont les sources lumineuses traditionnelles utilisées pour cette technique ; cependant, ils produisent les longueurs d'onde très fortes qui mènent au blanchiment et à la toxicité. Des lights emitting diode (LEDs) sont type utilisés car ils sont bon marché et compacts, ne mènent pas au blanchiment et des effets toxiques peuvent être exactement programmés.

Représentation à haute résolution

La définition d'un microscope détermine à quel point un microscope peut différencier entre différents deux objectifs attentivement mis. Bien que la microscopie à fluorescence de large-inducteur ait la haute résolution, la représentation 3D qu'épais échantillonne demeure difficile.

L'échantillon entier est examiné immédiatement, et il peut être provocant pour recenser la source précise de fluorescence. La fluorescence de mouvement propre peut également augmenter le bruit de l'image.

Dans photobleaching, les fluorophores réagissent et se modifient en covalence. Ceci mène à une image plus obscure car les fluorophores ne peuvent pas émettre la fluorescence, réduisant la définition de l'image produite.

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Last Updated: Oct 24, 2018

Hannah Simmons

Written by

Hannah Simmons

Hannah is a medical and life sciences writer with a Master of Science (M.Sc.) degree from Lancaster University, UK. Before becoming a writer, Hannah's research focussed on the discovery of biomarkers for Alzheimer's and Parkinson's disease. She also worked to further elucidate the biological pathways involved in these diseases. Outside of her work, Hannah enjoys swimming, taking her dog for a walk and travelling the world.

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