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microscopia di fluorescenza del Ampio-campo

la microscopia di fluorescenza del Ampio-campo è una tecnica di rappresentazione ampiamente applicata usata per esaminare le celle e studiare le loro strutture interne, compreso le proteine ed altre componenti cellulari.

Da VshivkovaCredito di immagine: Vshivkova/Shutterstock

In questa tecnica, l'intero campione è illuminato e una 2D immagine delle proteine multiple può essere identificata immediatamente.

Che cosa sono fluorophores?

Fluorophores è emozionante sopra l'assorbimento di una lunghezza d'onda specifica di indicatore luminoso, con conseguente movimento degli elettroni ad un livello energetico. Questi elettroni poi cadono al loro stato originale, piombo alla produzione di una lunghezza d'onda più lunga. La lunghezza d'onda assorbente è chiamata la lunghezza d'onda di eccitazione, mentre la lunghezza d'onda emessa è chiamata la lunghezza d'onda dell'emissione.

Rifornisce lo spostamento definisce la differenza fra questi valori. Ciascuno fluorophore può emettere ed assorbire le lunghezze d'onda differenti, che sono conosciute come loro spettri di emissione e di eccitazione. Questi intervalli inscatolano usato per definire i tipi differenti di fluorophore.

Preparato del campione

Alcuni campioni biologici contengono naturalmente i fluorophores (per esempio clorofilla). Alternativamente, i campioni biologici possono essere contrassegnati facendo uso dei metodi differenti, compreso l'immunofluorescenza, la manipolazione del DNA, o le macchie fluorescenti. L'immunofluorescenza usa gli anticorpi fluorophore-connessi, che riconoscono un antigene specifico e quindi contrassegnano la proteina di interesse.

La manipolazione del DNA, tuttavia, geneticamente modifica la proteina di interesse renderla fluorescente. Le macchie possono anche aggiungersi ad un campione che lega specificamente alla proteina di interesse. Per esempio, DAPI è una macchia dell'acido nucleico che identifica i nuclei legando a DNA.

Metodologia

Una lampada emette l'indicatore luminoso di eccitazione che attraversa un filtro ottico che assicura che soltanto le lunghezze d'onda specifiche di eccitazione cadano sul campione. L'indicatore luminoso poi è puntato sul campione via riflesso fuori da uno specchio dicroico.

I fluorophores emozionanti all'interno del campione emettono una lunghezza d'onda dell'più alta emissione che è individuata da una macchina fotografica. Questi dati poi sono quantificati ed usati per identificare la posizione specifica delle proteine all'interno del campione.

La sorgente luminosa

Mercurio o le arco-lampade del xeno è le sorgenti luminose tradizionali usate per questa tecnica; tuttavia, sia produce le lunghezze d'onda molto intense che piombo ad imbianchimento che alla tossicità. I diodi a emissione luminosa (LEDs) sono utilizzati tipicamente poichè sono economici e compatti, non non piombo all'imbianchimento e gli effetti tossici possono essere programmati esattamente.

Rappresentazione ad alta definizione

La risoluzione di un microscopio determina come un microscopio può differenziarsi fra i due oggetti molto attentamente collocati differenti. Sebbene la microscopia di fluorescenza del ampio-campo abbia alta risoluzione, la rappresentazione che 3D spesso campiona rimane difficile.

L'intero campione è esaminato immediatamente e può essere provocatorio identificare la sorgente precisa della fluorescenza. La fluorescenza di sfondo può anche aumentare il disturbo dell'immagine.

Nel photobleaching, i fluorophores si reagiscono ed in covalenza si modificano. Ciò piombo ad un'immagine più tenue poichè i fluorophores non possono emettere la fluorescenza, diminuente la risoluzione dell'immagine prodotta.

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Last Updated: Oct 24, 2018

Hannah Simmons

Written by

Hannah Simmons

Hannah is a medical and life sciences writer with a Master of Science (M.Sc.) degree from Lancaster University, UK. Before becoming a writer, Hannah's research focussed on the discovery of biomarkers for Alzheimer's and Parkinson's disease. She also worked to further elucidate the biological pathways involved in these diseases. Outside of her work, Hannah enjoys swimming, taking her dog for a walk and travelling the world.

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