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microscopia de fluorescencia del Ancho-campo

la microscopia de fluorescencia del Ancho-campo es una técnica de proyección de imagen extensamente aplicada usada para examinar las células y para investigar sus estructuras internas, incluyendo las proteínas y otros componentes celulares.

Por VshivkovaHaber de imagen: Vshivkova/Shutterstock

En esta técnica, la muestra entera está iluminada y una 2.a imagen de proteínas múltiples se puede determinar inmediatamente.

¿Cuáles son fluorophores?

Fluorophores es emocionado sobre la amortiguación de una longitud de onda específica de la luz, dando por resultado el movimiento de electrones a un nivel de una energía más alta. Estos electrones entonces bajan a su estado original, llevando a la producción de una longitud de onda más larga. La longitud de onda absorbente se llama la longitud de onda de la excitación, mientras que la longitud de onda emitida se llama la longitud de onda de la emisión.

Alimenta el movimiento define la diferencia entre estos valores. Cada uno fluoróforo puede emitir y absorber diversas longitudes de onda, que se conocen como sus espectros de la excitación y de emisión. Estos alcances pueden utilizado para definir diversos tipos de fluoróforo.

Preparación de la muestra

Algunas muestras biológicas contienen naturalmente los fluorophores (e.g clorofila). Alternativamente, las muestras biológicas se pueden etiqueta usando métodos diferentes, incluyendo inmunofluorescencia, la manipulación de la DNA, o manchas de óxido fluorescentes. La inmunofluorescencia utiliza los anticuerpos fluoróforo-conectados, que reconocen un antígeno específico y por lo tanto etiqueta la proteína del interés.

La manipulación de la DNA, sin embargo, genético modifica la proteína del interés de hacerla fluorescente. Las manchas de óxido se pueden también agregar a una muestra que ate específicamente a la proteína del interés. Por ejemplo, DAPI es una mancha de óxido del ácido nucléico que determina núcleos atando a la DNA.

Metodología

Una lámpara emite la luz de la excitación que pasa a través de un filtro óptico que se asegure de que solamente las longitudes de onda específicas de la excitación caigan en la muestra. La luz entonces se dirige la muestra vía la reflexión de un espejo dicroico.

Los fluorophores emocionados dentro de la muestra emiten una longitud de onda de una emisión más alta que sea descubierta por una cámara. Estos datos después se cuantifican y se utilizan para determinar la situación específica de las proteínas dentro de la muestra.

La fuente de luz

Las arco-lámparas del Mercury o del xenón son las fuentes de luz tradicionales usadas para esta técnica; sin embargo, producen las longitudes de onda muy intensas que llevan al blanqueo y a la toxicidad. Los diodos electroluminosos (LEDs) se utilizan típicamente como son baratos y compactos, no llevan al blanqueo y los efectos tóxicos pueden ser programados exacto.

Proyección de imagen de alta resolución

La resolución de un microscopio determina como de bien un microscopio puede distinguir entre diversos dos objetos de cerca puestos. Aunque la microscopia de fluorescencia del ancho-campo tenga alta resolución, la proyección de imagen que 3D grueso muestrea sigue siendo difícil.

La muestra entera se examina inmediatamente, y puede ser desafiadora determinar la fuente exacta de la fluorescencia. La fluorescencia del fondo puede también aumentar el ruido de la imagen.

En photobleaching, los fluorophores reaccionan y covalente se modifican. Esto lleva a una imagen más oscuro como los fluorophores no pueden emitir fluorescencia, reduciendo la resolución de la imagen producida.

Fuentes:

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Last Updated: Oct 24, 2018

Hannah Simmons

Written by

Hannah Simmons

Hannah is a medical and life sciences writer with a Master of Science (M.Sc.) degree from Lancaster University, UK. Before becoming a writer, Hannah's research focussed on the discovery of biomarkers for Alzheimer's and Parkinson's disease. She also worked to further elucidate the biological pathways involved in these diseases. Outside of her work, Hannah enjoys swimming, taking her dog for a walk and travelling the world.

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