Sistemi dell'due-ibrido del lievito (Y2H)

Il sistema dell'due-ibrido del lievito (Y2H) è una tecnica genetica usata per determinare le interazioni della proteina-proteina. L'approccio è veloce, redditizio e di facile impiego.

Credito: Kateryna Kon/Shutterstock

La mappatura di interazione dà le chiare spiegazioni circa l'organizzazione del proteome (organismi, i tessuti e le celle esprimono il complemento completo delle proteine) nelle unità funzionali. Questi dati sono critici per la delucidazione dei meccanismi biologici.

Gli strumenti di Y2H serviscono da accesso all'intero proteome cellulare per la schermatura dell'interazione della proteina-proteina, compreso le proteine della membrana, le proteine localizzate in compartimenti sottocellulari differenti e le proteine che sono transcriptionally attive.

Y2H può essere automatizzatoe per alta capacità di lavorazione ricerca di interazione della proteina-proteina su un disgaggio genoma di ampiezza.

Principio del sistema di Y2H

interazione della Proteina-proteina che ha luogo fra esca e gli aiuti delle proteine della preda nell'attivazione dei geni del reporter che permettono la crescita su una reazione al colore o sui media specifici.

Il termine “due-ibrido„ è punzonato dalle due classi di proteine ibride o chimeriche. Proteina di interesse “x„ e di un fusibile obbligatorio del dominio del DNA (DBD-x) formare “esca.„ Fusione dei risultati trascrizionali del dominio di attivazione (Annuncio-y) e della libreria “y„ del cDNA “in preda.„ Queste due classi costituiscono la base del sistema di rilevamento di interazione della proteina-proteina.

Senza interazione della esca-preda, il dominio di attivazione non può limitare all'unità di espressione del gene--gene del reporter.

Variazioni di Y2H

Le variazioni nel sistema di Y2H dipendono dall'interazione delle proteine. I sistemi disponibili della corrente sono:

Sistema represso di transactivator

Il sistema represso (RTA) di transactivator Y2H è stato creato per identificare le interazioni che comprendono le proteine trascrizionali dell'attivatore geneticamente.

Le modifiche in questo sistema gli permettono di essere usate per il video degli inibitori delle interazioni della proteina-proteina che comprendono le librerie di piccoli composti della molecola.

L'inibizione di interazioni che comprendono le proteine può essere valutata schermando la crescita nel media selettivo che contiene 3 il aminotriazole (3-AT).

Questo metodo egualmente è stato utilizzato per identificare le inibizioni di quattro interazioni indipendenti della proteina-proteina in schermi che hanno contenuto una piccola libreria del composto della molecola 23.000. I composti che quello inibito del FKBP12-TGFbeta-R (fattore di crescita di trasformazione beta) egualmente è stato inibito.

Sistema della trascrizione della polimerasi III

La polimerasi III (sistema della trascrizione del politico III) permette l'interazione dei fattori di trascrizione con le proteine attivando la trascrizione che è basata sul RNA polimerasi II. La proteina X è fusa per adescare (Gal4-DBD) nel sistema tradizionale di Y2H. L'inizio della sequenza obbligatoria di Gal4p in SNR6 (gene del reporter) provoca la capacità di esca di fissare il DNA.

Tuttavia, la costruzione della preda è alterata mentre la seconda proteina Y ottiene fusa al complesso di τ138p.TFIIC contiene questa proteina come sottounità.

τ138p esiste come uno dei due fattori di trascrizione che subisce (politico del RNA polimerasi III) III-ha mediato la trascrizione. L'interazione che si presenta fra l'esca ed i risultati della preda (che contiene τ138p) in associazione del complesso di TFIIIC a DNA e l'assunzione di TFIIIB (un secondo fattore di trascrizione) e del politico III.

Ciò provoca l'attivazione della trascrizione del gene del reporter SNR6 per sviluppare lo snRNA U6.

Selezione per le interazioni fra il sistema extracellulare delle proteine

La selezione per le interazioni fra il sistema extracellulare delle proteine (sistema di SCINEX-P) permette l'analisi delle interazioni della proteina che hanno luogo nell'ambiente d'ossidazione del reticolo endoplasmatico.

In questo sistema, la fusione ha luogo fra le proteine mutate di Ire1p e le proteine di interesse, dove le proteine mutate di Ire1p mancano del loro dominio luminal.

L'interazione che si presenta fra i due risultati ibridi delle proteine nella ricostituzione della dimerizzazione di Ire1p e nell'attivazione della segnalazione a valle spiegata (UPR) di risposta della proteina. Il Hac1p ha spiegato l'elemento di risposta della proteina che è stato introdotto nelle guide del promotore del gene del reporter nell'interazione della proteina-proteina della selezione.

Questo sistema di Y2H è stato applicato con successo per l'analisi di interazione fra Calnexin e l'isomerasi ERp57 del bisolfuro della proteina e le interazioni fra gli anticorpi e gli antigeni.

SOS ed i sistemi di assunzione di RAS (SRS e RRS)

Il sistema di assunzione di SOS comprende la fusione di una proteina solubile X nel SOS mammifero. Interazione fra fusione di SOS-X e una preda che è localizzata nei risultati di una membrana nella promozione della segnalazione a valle e nello stimolo dello scambio di guanyl su yRAS.

Il sistema di assunzione di RAS comprende la fusione di RAS mammifero attivo e della proteina solubile X. Il sistema richiede soltanto la posizione della membrana e non comprende attività di Ras di guanyl dei fattori di scambio'.

Sia RRS che SRS aiutano nell'analizzare le interazioni che si presentano fra la membrana o le esche solubili solubili e del preda. Il sistema inverso di assunzione di RAS è stato messo a punto specialmente per utilizzazione delle esche che sono membrana localizzata.

Il sistema di fusione della G-proteina

Questo sistema permette l'interazione fra esca e la preda solubile, che comprende la proteina di fusione con l'sottounità di gamma della G-proteina heterotrimeric.

L'interazione della preda con esca che è situata sulla membrana provoca il sequestro dei risultati degli β-sottounità della G-proteina nella rottura della formazione complessa della G-proteina heterotrimeric e della segnalazione a valle successiva.

Questo approccio è più comunemente usato nell'identificazione dei mutanti di un neurone Sec1 che sono incapaci di legare syntaxin1 (un membro complesso della TRAPPOLA).

Oltre a RTA Y2H, la G-proteina Y2H identifica le droghe che interrompono le interazioni della proteina-proteina.

Sorgenti:

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24581437
  2. https://www.researchgate.net/figure/10998230_fig1_Figure-1-Principle-of-the-yeast-two-hybrid-system
  3. http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.138.1135&rep=rep1&type=pdf  
  4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17515203
  5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2705515/
  6. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20439416
  7. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC140126/

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Last Updated: Feb 26, 2019

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