Sistemas do dois-híbrido do fermento (Y2H)

O sistema do dois-híbrido do fermento (Y2H) é uma técnica genética usada para determinar interacções da proteína-proteína. A aproximação é rápida, eficaz na redução de custos, e fácil de usar.

Crédito: Kateryna Kon/Shutterstock

O traço da interacção dá explicações claras sobre a organização do proteome (os organismos, os tecidos, e as pilhas expressam o complemento completo de proteínas) em unidades funcionais. Estes dados são críticos para a elucidação de mecanismos biológicos.

As ferramentas de Y2H servem como o acesso ao proteome celular inteiro para selecionar a interacção da proteína-proteína, incluindo proteínas da membrana, proteínas localizadas em compartimentos subcelulares diferentes, e proteínas que são transcriptionally activas.

Y2H pode ser automatizado para a produção alta pesquisa da interacção da proteína-proteína em uma escala genoma-larga.

Princípio do sistema de Y2H

interacção da Proteína-proteína que ocorre entre a isca e os auxílios das proteínas da rapina na activação dos genes do repórter que permitem o crescimento em uma reacção de cor ou em uns media específicos.

O termo “dois-híbrido” é inventado das duas classes de proteínas híbridas ou quiméricoas. Proteína do interesse “x” e de um fusível obrigatório do domínio do ADN (DBD-x) formar a “isca.” Fusão de resultados transcricionais do domínio da activação (Anúncio-y) e da biblioteca um “y” do cDNA na “rapina.” Estas duas classes formam a base do sistema de detecção da interacção da proteína-proteína.

Sem interacção da isca-rapina, o domínio da activação não pode restringir à movimentação da expressão do gene-à-gene do repórter.

Variações de Y2H

As variações no sistema de Y2H dependem da interacção das proteínas. Os sistemas disponíveis da corrente são:

Sistema reprimido do transactivator

O sistema reprimido (RTA) do transactivator Y2H foi criado para identificar as interacções que envolvem proteínas transcricionais do activador genetically.

As alterações neste sistema permitem-no de ser usadas monitorando inibidores das interacções da proteína-proteína que envolvem bibliotecas de compostos pequenos da molécula.

A inibição de interacções que envolvem proteínas pode ser avaliada selecionando o crescimento no media selectivo que contem o aminotriazole 3 (3-AT).

Este método foi utilizado igualmente para identificar inibições de quatro interacções independentes da proteína-proteína nas telas que contiveram uma biblioteca pequena do composto da molécula 23.000. Os compostos que inibido do FKBP12-TGFbeta-R (factor de crescimento de transformação beta) estêve inibido igualmente.

Sistema da transcrição da polimerase III

O sistema da transcrição da polimerase III (político III) permite a interacção de factores da transcrição com proteínas ativando a transcrição que é baseada na polimerase de RNA II. A proteína X é fundida para atrair (Gal4-DBD) no sistema tradicional de Y2H. A iniciação da seqüência obrigatória de Gal4p em SNR6 (gene do repórter) conduz à capacidade da isca para anexar o ADN.

Não obstante, a construção da rapina é alterada enquanto a segunda proteína Y obtem fundida ao complexo de τ138p.TFIIC contem esta proteína como uma subunidade.

τ138p existe como um dos dois factores da transcrição que se submete (polimerase de RNA III) ao político Iii-negociou a transcrição. A interacção que ocorre entre a isca e os resultados da rapina (que contem τ138p) na ligação do complexo de TFIIIC ao ADN e o recrutamento de TFIIIB (um segundo factor da transcrição) e de político III.

Isto conduz à activação da transcrição do gene do repórter SNR6 para desenvolver o snRNA U6.

Selecção para interacções entre o sistema extracelular das proteínas

A selecção para interacções entre o sistema extracelular das proteínas (sistema de SCINEX-P) permite a análise das interacções da proteína que ocorrem no ambiente de oxidação do segundo estômago endoplasmic.

Neste sistema, a fusão ocorre entre as proteínas transformadas de Ire1p e as proteínas do interesse, onde as proteínas transformadas de Ire1p faltam seu domínio luminal.

A interacção que ocorre entre os dois resultados híbridos das proteínas na reconstituição do dimerization de Ire1p e na activação da sinalização a jusante desdobrada (UPR) da resposta da proteína. O Hac1p desdobrou o elemento da resposta da proteína que foi introduzido nas ajudas do promotor do gene do repórter na interacção da proteína-proteína da selecção.

Este sistema de Y2H foi executado com sucesso para a análise da interacção entre Calnexin e isomerase ERp57 do bissulfeto da proteína, e as interacções entre anticorpos e antígenos.

SOS e os sistemas do recrutamento de RAS (SRS e RRS)

O sistema do recrutamento do SOS envolve a fusão de uma proteína solúvel X no SOS mamífero. Interacção entre a fusão de SOS-X e uma rapina que seja localizada em resultados de uma membrana na promoção da sinalização a jusante e na estimulação da troca do guanyl no yRAS.

O sistema do recrutamento de RAS envolve a fusão de RAS mamífero activo e da proteína solúvel X. O sistema exige somente o lugar da membrana e não envolve actividade dos factores da troca do guanyl de Ras'.

RRS e SRS ajudam em analisar as interacções que ocorrem entre a membrana ou iscas solúveis do rapina e as solúveis. O sistema reverso do recrutamento de RAS foi desenvolvido particularmente para a utilização das iscas que são membrana localizada.

O sistema da fusão da G-proteína

Este sistema permite a interacção entre a isca e a rapina solúvel, que envolve a proteína da fusão com a subunidade da gama da G-proteína heterotrimeric.

A interacção da rapina com isca que é ficada situada na membrana conduz ao seqüestro de resultados de β-subunidades da G-proteína no rompimento da formação complexa da G-proteína heterotrimeric e da sinalização a jusante sucessiva.

Esta aproximação é a mais de uso geral na identificação dos mutantes Sec1 neuronal que são incapazes de ligar syntaxin1 (um membro complexo da CILADA).

Além do que RTA Y2H, a G-proteína Y2H identifica as drogas que interrompem interacções da proteína-proteína.

Fontes:

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24581437
  2. https://www.researchgate.net/figure/10998230_fig1_Figure-1-Principle-of-the-yeast-two-hybrid-system
  3. http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.138.1135&rep=rep1&type=pdf  
  4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17515203
  5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2705515/
  6. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20439416
  7. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC140126/

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Last Updated: Feb 26, 2019

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