Sistemas del dos-híbrido de la levadura (Y2H)

El sistema del dos-híbrido de la levadura (Y2H) es una técnica genética usada para determinar acciones recíprocas de la proteína-proteína. La aproximación es rápida, de poco costo, y fácil de utilizar.

Haber: Kateryna Kon/Shutterstock

La correspondencia de la acción recíproca da explicaciones sin obstrucción sobre la organización del proteome (los organismos, los tejidos, y las células expresan el complemento completo de proteínas) en unidades funcionales. Estos datos son críticos para la aclaración de mecanismos biológicos.

Las herramientas de Y2H sirven como acceso al proteome celular entero para revisar la acción recíproca de la proteína-proteína, incluyendo las proteínas de la membrana, las proteínas localizadas en diversas divisiones subcelulares, y las proteínas que son transcriptionally activas.

Y2H se puede automatizar para la alta producción investiga de la acción recíproca de la proteína-proteína en una escala genoma-ancha.

Principio del sistema de Y2H

acción recíproca de la Proteína-proteína que ocurre entre el cebo y los socorros de las proteínas de la presa en la activación de los genes del reportero que permiten incremento en una coloración o ambientes específicos.

El término “dos-híbrido” se acuña de las dos clases de proteínas híbridas o quiméricas. Proteína del interés “x” y de un fusible obligatorio del dominio de la DNA (DBD-x) de formar “cebo.” Fusión de los resultados transcriptivos del dominio de la activación (Anuncio-y) y de la biblioteca una “y” del cDNA en “presa.” Estas dos clases forman la base del sistema de detección de la acción recíproca de la proteína-proteína.

Sin la acción recíproca de la cebo-presa, el dominio de la activación no puede restringir a la impulsión de la expresión del gen-a-gen del reportero.

Variaciones de Y2H

Las variaciones en el sistema de Y2H dependen de la acción recíproca de proteínas. Los sistemas disponibles de la corriente son:

Sistema reprimido del transactivator

El sistema reprimido (RTA) del transactivator Y2H fue creado para determinar las acciones recíprocas que implican las proteínas transcriptivas del activador genético.

Las modificaciones en este sistema le permiten ser utilizadas para vigilar los inhibidores de las acciones recíprocas de la proteína-proteína que implican las bibliotecas de las pequeñas composiciones de la molécula.

La inhibición de las acciones recíprocas que implican las proteínas puede ser evaluada revisando incremento en el ambiente selectivo que contiene el aminotriazole 3 (3-AT).

Este método también se ha utilizado para determinar inhibiciones de cuatro acciones recíprocas independientes de la proteína-proteína en las pantallas que contuvieron una pequeña biblioteca de la composición de la molécula 23.000. Las composiciones que inhibida del FKBP12-TGFbeta-R (factor de incremento de transformación beta) también fue inhibido.

Sistema de la transcripción de la polimerasa III

La polimerasa III (sistema de la transcripción del político III) permite la acción recíproca de los factores de la transcripción con las proteínas activando la transcripción que se basa en la polimerasa de ARN II. La proteína X se funde para hostigar (Gal4-DBD) en el sistema tradicional de Y2H. El lanzamiento de la serie obligatoria de Gal4p en SNR6 (gen del reportero) da lugar a la capacidad del cebo de sujetar la DNA.

Sin embargo, se altera la construcción de la presa mientras que la segunda proteína Y consigue fundida al complejo de τ138p.TFIIC contiene esta proteína como subunidad.

τ138p existe mientras que uno de los dos factores de la transcripción que experimente (político de la polimerasa de ARN III) III-medió la transcripción. La acción recíproca que ocurre entre el cebo y los resultados de la presa (que contiene τ138p) en atar del complejo de TFIIIC a la DNA y el reclutamiento de TFIIIB (un segundo factor de la transcripción) y del político III.

Esto da lugar a la activación de la transcripción del gen del reportero SNR6 para desarrollar el snRNA U6.

Investigación para las acciones recíprocas entre el sistema extracelular de las proteínas

La investigación para las acciones recíprocas entre el sistema extracelular de las proteínas (sistema de SCINEX-P) permiso el análisis de las acciones recíprocas de la proteína que ocurren en el ambiente oxidante del retículo endoplásmico.

En este sistema, la fusión ocurre entre las proteínas transformadas de Ire1p y las proteínas del interés, donde las proteínas transformadas de Ire1p faltan su dominio luminal.

La acción recíproca que ocurre entre los dos resultados híbridos de las proteínas en la reconstitución de la dimerización de Ire1p y la activación de la transmisión de señales rio abajo revelada (UPR) de la reacción de la proteína. El Hac1p reveló el elemento de la reacción de la proteína que se ha introducido en las ayudas del promotor del gen del reportero en la acción recíproca de la proteína-proteína de la investigación.

Este sistema de Y2H se ha ejecutado con éxito para el análisis de la acción recíproca entre Calnexin y la isomerasa ERp57 del disulfuro de la proteína, y las acciones recíprocas entre los anticuerpos y los antígenos.

SOS y los sistemas del reclutamiento de RAS (SRS y RRS)

El sistema del reclutamiento el SOS implica la fusión de una proteína soluble X en el SOS mamífero. Acción recíproca entre la fusión de SOS-X y una presa que se localiza en resultados de una membrana en la promoción de la transmisión de señales rio abajo y el estímulo de la cantina del guanyl en yRAS.

El sistema del reclutamiento de RAS implica la fusión de RAS mamífero activo y de la proteína soluble X. El sistema requiere solamente la situación de la membrana y no implica actividad de Ras del guanyl de los factores de la cantina'.

RRS y SRS ayudan en analizar las acciones recíprocas que ocurren entre la membrana o los cebos solubles del presa y solubles. El sistema reverso del reclutamiento de RAS se ha desarrollado determinado para la utilización de los cebos que son membrana localizada.

El sistema de la fusión de la G-proteína

Este sistema permiso la acción recíproca entre el cebo y la presa soluble, que implica la proteína de la fusión con la subunidad gamma de la G-proteína heterotrimeric.

La acción recíproca de la presa con el cebo que está situado en la membrana da lugar al secuestro de los resultados de las β-subunidades de la G-proteína en la desorganización de la formación compleja de la G-proteína heterotrimeric y de la transmisión de señales rio abajo sucesiva.

Esta aproximación es la más de uso general de la identificación de los mutantes neuronales Sec1 que son incapaces de atar syntaxin1 (pieza compleja de la TRAMPA).

Además de RTA Y2H, la G-proteína Y2H determina las drogas que rompen acciones recíprocas de la proteína-proteína.

Fuentes:

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24581437
  2. https://www.researchgate.net/figure/10998230_fig1_Figure-1-Principle-of-the-yeast-two-hybrid-system
  3. http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.138.1135&rep=rep1&type=pdf  
  4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17515203
  5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2705515/
  6. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20439416
  7. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC140126/

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Last Updated: Feb 26, 2019

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