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Plus rapide de nouvelles techniques de clonage - transcription basée sur le clonage

Un seul brin d'ADN végétale ou animale peuvent contenir des dizaines de milliers de gènes, chacun programmé pour produire une protéine spécifique indispensable à la croissance ou la survie de l'organisme. Le défi pour les généticiens est d'isoler des gènes et de déterminer leur fonction - un processus laborieux qui nécessite souvent des années d'essais en laboratoire et d'erreur.

Maintenant, une équipe internationale de chercheurs a découvert une technique qui simplifie considérablement ce processus pour certains types de gènes. Développé par des scientifiques de l'Université de Stanford et de la Grande-Bretagne, John Innes Centre, la nouvelle procédure pourrait permettre aux scientifiques d'identifier des gènes spécifiques dans une affaire de mois plutôt qu'en années. La technique, connue sous le nom de clonage basée sur la transcription, est décrite dans le Mars édition du 30 les Actes de l'Académie nationale des sciences (PNAS).

"Nous pensons que cette méthode représente une percée importante dans le clonage de gènes», écrivent les auteurs de l'étude de PNAS.

«Le plus grand impact de cette technologie est susceptible d'être sur les plantes dont les génomes sont vastes et complexes, y compris la plupart des espèces de cultures», a ajouté Sharon R. Long, William C. Steere, Jr., Pfizer Inc professeur en sciences biologiques à Stanford et co-auteur de l'étude. Long, qui sert également en tant que doyen de la Stanford School de lettres et des sciences, est une autorité sur la biologie moléculaire des bactéries et des plantes. Elle et ses collègues ont utilisé la technique du clonage de nouveaux afin d'isoler et d'identifier un gène dans l'ADN de Medicago truncatula, ou le baril médecin - un membre de la famille des légumineuses qui est étroitement liée à la luzerne, les haricots et les pois.

«Au cours des six mois, nous avons terminé ce qui s'est un autre groupe de plusieurs années pour compléter, et nous avons identifié un gène assez cool pour démarrer", a déclaré Stanford, stagiaire postdoctoral Raka M. Mitra, auteur principal de l'étude de PNAS. "Nous pensons que cette technologie sera applicable à d'autres espèces et nous espérons que cela augmente le rythme de la recherche biologique sur l'ensemble."

La génétique inverse

Medicago ADN contient des milliers de gènes, et en utilisant des méthodes traditionnelles pour comprendre ce que chacun fait est un processus fastidieux. "L'approche standard utilisée par les généticiens - connu comme le clonage de gènes - consiste à briser le système de manière très contrôlée, puis traquer ce qui est brisé», a expliqué de Mitra.

Ce processus commence par hasard le zapping des milliers de graines de plantes avec le rayonnement, puis de plus en plus les graines exposées dans un laboratoire. L'objectif est d'amasser une plante mutante avec une mutation physique évidente, puis effectuez une recherche à travers l'ADN de l'usine jusqu'à ce que le gène muté d'intérêt est identifié. Par exemple, si les chercheurs voulaient trouver les gènes responsables de la croissance des racines normales, ils auraient l'air pour une usine de mutant avec des racines défectueux et ensuite effectuer une analyse exhaustive de l'ADN de l'usine jusqu'à ce qu'ils trouvent les gènes défectueux qui a causé le dommage.

«Clonage de gènes dans M. truncatula peut prendre de trois à cinq ans, en partie parce qu'elle nécessite la fertilisation croisée de deux générations de plantes», Mitra dit. «Je me demandais si on pouvait contourner cette chasse laborieuse pour les gènes j'ai commencé à partir de la prémisse que des gènes mutés produire des protéines mutées -.. Et peut même empêcher la production de la protéine entièrement»

Dans les cellules animales et végétales saines, la production de protéines commence avec le gène - un court tronçon de l'ADN constitué de produits chimiques disposés dans un ordre spécifique qui contient les instructions pour la construction de la protéine. Ces instructions sont copiées à partir de l'ADN sur une molécule d'ARN dans un processus appelé transcription. La copie d'ARN, ou de la transcription, puis se déplace à l'autre partie de la cellule, où il est utilisé comme modèle pour la fabrication de la protéine.

Gènes mutés, cependant, portent des instructions erronées qui produisent des copies défectueuses d'ARN, dont la cellule tente d'éliminer aussi vite que possible - un fait qui a conduit Mitra et ses collègues de prédire que ARN défectueux ne se manifesterait dans les très faibles concentrations dans les cellules mutées .

Mais l'inverse serait également vrai? Si une cellule produit des quantités faibles d'un transcrit d'ARN, ce que cela signifie l'ARN est le produit défectueux d'un gène endommagé? Si c'est le cas, les chercheurs pourraient simplifier l'ensemble du gène-identification du processus en utilisant la génétique inverse. D'abord, ils auraient l'air d'ARN qui se produisent à de faibles concentrations et de déterminer la séquence chimique de ces molécules d'ARN, puis utiliser ces informations pour localiser le gène correspondant sur l'ADN de la plante.

Fixation de l'azote

Dans l'expérience de PNAS, Mitra et ses collègues ont utilisé leur nouvelle technique de clonage basée sur la transcription d'identifier un gène végétal qui joue un rôle important dans la production d'azote utilisable pour les plantes et les animaux. Tous les êtres vivants ont besoin d'azote pour fabriquer des protéines. Malheureusement, l'azote gazeux, ce qui représente près de 80 pour cent de l'atmosphère, est inutilisable par les plantes et les animaux.

Cependant, il ya terricoles bactéries qui transforment l'azote atmosphérique en un composé que les plantes peuvent absorber dans leurs racines, puis les convertir en protéines - un processus appelé fixation de l'azote. Les animaux, à leur tour, obtiennent leur première source d'azote à partir de plantes, ce qui rend la fixation d'azote des bactéries indispensables à tous les animaux - et humain - la vie.

«Notre laboratoire a un objectif particulier - d'identifier les gènes qui permettent aux plantes d'établir une symbiose bénéfique pour la fixation d'azote, qui est aussi une clé pour une agriculture durable,« Long noté. Dans le cadre de cet effort, elle et ses collègues ont étudié la signalisation chimique complexe qui se produit entre bactéries fixatrices d'azote et les plantes. Les chercheurs ont découvert que Medicago et d'autres légumineuses permettent aux bactéries d'envahir leurs racines et de s'installer dans la tumeur comme des organes, appelées nodules.

"Cette relation est mutuellement bénéfique", a expliqué de Mitra. "Les bactéries en profitent car ils sont enfermés dans un environnement protecteur - le nodule - où ils sont nourris sucres de la plante Les avantages des plantes parce que les bactéries transforment l'azote de l'air en ammoniac, ce qui la plante utilise pour fabriquer des protéines.."

Exactement comment les légumineuses et les bactéries de communiquer reste un mystère. "Pour des raisons inconnues, dans les minutes de la reconnaissance du signal chimique bactérienne, les niveaux de calcium dans les cellules des racines de la plante commence oscillante», Mitra dit. "Ces niveaux augmentent rapidement, puis lentement déroulant Ce processus -. Calcium appelé dopage -. Répète encore et encore, à un taux d'environ une oscillation par minute, et se poursuit pendant des heures"

Dans un effort pour mieux comprendre ce phénomène, l'équipe de recherche a comparé les plantes de Medicago normale avec une version mutante soulevées dans le laboratoire. "Ce mutant a été particulièrement intéressant pour nous car il présentait un comportement de dopage de calcium, mais a été incapable d'établir une relation symbiotique avec des bactéries fixatrices d'azote», Mitra dit.

Utiliser microréseaux de gènes technologie de la puce, les chercheurs ont surveillé les niveaux d'ARN produites par 10 000 gènes dans les plantes normales et mutantes. «Dans les plantes mutantes, nous avons trouvé un gène, appelé DMI3, qui a produit des niveaux extrêmement bas de l'ARN», Mitra dit. "La version normale du gène DMI3 produit une protéine qui est remarquablement similaire aux protéines végétales de tabac qui sont connus pour moduler leurs comportements en réponse au calcium."

Ce constat a conduit l'équipe de recherche à conclure que le gène DMI3 pourrait jouer un rôle important dans la réponse de la plante à des oscillations de calcium. Le mois dernier, une équipe de recherche français et néerlandais a publié des résultats similaires dans la revue Science. Cependant, ce groupe a utilisé les méthodes traditionnelles de clonage de gènes pour identifier DMI3 - un processus qui a pris au moins quatre ans pour terminer, contre six mois en utilisant la transcription basée sur le clonage.

"L'essentiel est présent," Long dit. «Dans le processus de travail sur la fixation d'azote, nous avons découvert une méthode générale pour l'identification et le clonage de gènes végétaux important qui est rapide et peut être applicable à presque toutes les espèces végétales."