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Técnica nova Mais Rápida da clonagem - clonagem transcrito-baseada

Uma única costa do ADN da planta ou do animal pode conter dez dos milhares de genes, cada um programado para produzir uma proteína específica essencial para o crescimento ou a sobrevivência do organismo. O desafio para geneticista é isolar genes individuais e determinar sua função - um processo cuidadoso que exige frequentemente anos de tentativa e erro do laboratório.

Uma equipa de investigação internacional tem descoberto Agora uma técnica que aerodinamizasse dramàtica tipos deste processo com certeza dos genes. Tornado por cientistas no Centro de John Innes da Universidade de Stanford e da Grâ Bretanha, o procedimento novo podia permitir cientistas de identificar genes específicos em uma matéria dos meses, não anos. A técnica, conhecida como a clonagem transcrito-baseada, é descrita na edição do 30 de março das Continuações da Academia Nacional das Ciências (PNAS).

“Nós acreditamos que este método representa uma descoberta significativa na clonagem de gene,” escrevemos os autores do estudo de PNAS.

“O grande impacto desta tecnologia é provável estar em plantas com grande e os genomas complexos, incluindo a maioria de espécie de colheita,” adicionou Sharon R. Longo, o William C. Steere, Jr. - Professor de Pfizer Inc. em Ciências Biológicas em Stanford e co-autor do estudo. Por Muito Tempo, que igualmente serve como o decano da Escola de Stanford das Humanidades e das Ciências, é uma autoridade na biologia molecular bacteriana e da planta. E seus colegas usaram a técnica nova da clonagem para isolar e identificar um gene no ADN do truncatula do Medicago, ou o médico do tambor - um membro da família de leguminosa que é estreitamente relacionada à alfafa, aos feijões e às ervilhas.

“No curso de seis meses, nós terminamos o que tomou a um outro grupo diversos anos para terminar, e nós identificamos um gene consideravelmente fresco para carreg,” disse o companheiro pos-doctoral Raka M. Mitra de Stanford, autor principal do estudo de PNAS. “Nós pensamos que esta tecnologia será aplicável à outra espécie e esperará que aumenta o ritmo da pesquisa biológica em geral.”

Genética Reversa

O ADN do Medicago contem milhares de genes, e usar os métodos tradicionais para figurar para fora o que cada uma faz é um processo demorado. “A aproximação padrão usada pelos geneticista da planta - conhecidos como a clonagem de gene - envolve dividir o sistema em uma maneira muito controlada, e então caçá-lo abaixo do que seja quebrada,” Mitra explicou.

Este processo começa aleatòria zapping milhares de sementes da planta com a radiação, a seguir crescendo as sementes expor em um laboratório. O objetivo é aumentar uma planta do mutante com uma mutação física óbvia, a seguir procurara através do ADN da planta até que o gene transformado do interesse esteja identificado. Por exemplo, se os pesquisadores quiseram encontrar os genes responsáveis para o crescimento normal da raiz, procuraram uma planta do mutante com raizes defeituosas e conduziram então uma análise exaustiva do ADN da planta até que encontraram os genes defeituosos que causaram o dano.

De “a clonagem Gene no truncatula do M. pode tomar três a cinco anos, na parte porque exige a fertilização cruzada de duas gerações de plantas,” Mitra disse. “Eu quis saber se nós poderíamos contornar esta caça laboriosa para genes. Eu parti dos locais que os genes transformados produzem proteínas transformadas - e podem mesmo impedir a produção da proteína inteiramente.”

Em pilhas saudáveis do vegetal e animal, a produção da proteína começa com o gene - um estiramento curto do ADN compo dos produtos químicos arranjados em uma seqüência específica que contenha as instruções para construir a proteína. Aquelas instruções são copiadas do ADN em uma molécula do RNA em um processo chamado transcrição. A cópia do RNA, ou o transcrito, movem-se então para uma outra parte da pilha, onde é usada como um molde para fabricar a proteína.

Os genes Transformados, contudo, levam as instruções defeituosas que produzem as cópias defeituosas do RNA, que a pilha tenta eliminar o mais rapidamente possível - um facto isso conduziu Mitra e seus colegas prever que o RNA defeituoso apareceria somente em concentrações muito baixas em pilhas transformadas.

Mas o reverso igualmente seria verdadeiro? Se uma pilha produz baixas quantidades de um transcrito do RNA, aquela significa o RNA é o produto defeituoso de um gene danificado? Em caso afirmativo, os pesquisadores poderiam aerodinamizar o processo inteiro da gene-identificação usando a genética reversa. Primeiramente, procurariam RNAs que ocorrem em baixas concentrações e determinam a seqüência química daquelas moléculas do RNA, a seguir usam essa informação para encontrar o gene de harmonização no ADN da planta.

Fixação de Nitrogênio

Na experiência de PNAS, Mitra e seus colegas de trabalho usaram sua técnica clonando transcrito-baseada nova para identificar um gene da planta que jogasse um papel importante na produção de nitrogênio útil para vegetais e animal. Todas As coisas vivas precisam o nitrogênio de fazer proteínas. Infelizmente, o gás do nitrogênio, que compo quase 80 por cento da atmosfera, é inusável por vegetais e animal.

Contudo, há as bactérias da solo-moradia que transformam o nitrogênio atmosférico em um composto que as plantas possam absorver em suas raizes e então converter em proteínas - um processo chamado fixação de nitrogênio. Os Animais, por sua vez, obtêm sua fonte primária de nitrogênio das plantas, que faz a fixação de nitrogênio bacteriana essencial a todo o animal - e a ser humano - vida.

“Nosso laboratório tem um objetivo particular - para identificar os genes que permitem que as plantas estabeleçam a simbiose benéfica para a fixação de nitrogênio, que é igualmente uma chave à agricultura sustentável,” notáveis Por Muito Tempo. Como parte desse esforço, e seus colegas têm estudado a sinalização química complexa que ocorre entre as bactérias da nitrogênio-fixação e as plantas. Os Pesquisadores descobriram que o Medicago e outras leguminosa permitem que as bactérias invadam suas raizes e peguem a residência dentro tumor-como os órgãos chamados nódulos.

“Este relacionamento é mutuamente benéfico,” Mitra explicou. “As bactérias beneficiam-se porque são encerradas em um ambiente protector - o nódulo - onde são alimentadas açúcares da planta. A planta beneficia-se porque as bactérias convertem o nitrogênio do ar na amônia, que a planta se usa para fazer a proteínas.”

Exactamente como as leguminosa e as bactérias comunicam sobras algo de um mistério. “Para razões desconhecidas, dentro de minutos de reconhecer o sinal químico bacteriano, os níveis do cálcio nas pilhas de raiz da planta começam oscilar,” Mitra disse. “Estes níveis aumentam ràpida, a seguir deixam cair lentamente para baixo. Este processo - cravação chamada do cálcio - as repetições repetidamente, a uma taxa de aproximadamente uma oscilação pela acta, e continua por horas.”

Em um esforço para compreender melhor este fenômeno, a equipa de investigação comparou plantas normais do Medicago com uma versão do mutante levantada no laboratório. “Este mutante era particularmente interessante a nós porque exibiu o cálcio que crava o comportamento mas foi que incapaz de estabelecer um relacionamento simbiótico com bactérias da nitrogênio-fixação,” Mitra disse.

Usando a tecnologia da gene-microplaqueta do microarray, os pesquisadores monitoraram os níveis do RNA produzidos por 10.000 genes no normal e nas plantas do mutante. “Nas plantas do mutante, nós encontramos um gene, chamado DMI3, que produziu extremamente - baixos níveis de RNA,” Mitra disse. “A versão normal do gene DMI3 produz uma proteína que seja notàvel similar às proteínas de planta do tabaco que são sabidas para modular seus comportamentos em resposta ao cálcio.”

Isto que encontra conduziu a equipa de investigação concluir que o gene DMI3 pode jogar um papel importante na resposta da planta às oscilações do cálcio. No mês passado, uma equipa de investigação Holandesa e Francesa publicou resultados semelhantes na Ciência do jornal. Contudo, esse grupo usou métodos tradicionais da clonagem de gene para identificar DMI3 - um processo que tomasse pelo menos quatro anos a completo, comparado a seis meses usando a clonagem transcrito-baseada.

“Os ganhos líquidos são este,” Longo disse. “Em processo do trabalho na fixação de nitrogênio, nós descobrimos um método geral para identificar e clonar genes importantes da planta que é rápida e pode ser aplicável a quase qualquer espécie da planta.”