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Investigadores desarrollan un método de electroforesis para la detección de nuevos MIRCERA y EPO en la sangre

Nuevo enfoque reduce el número de procedimientos necesarios para detectar las eritropoyetinas

Investigadores australianos han desarrollado con éxito un nuevo método de electroforesis para la detección de MIRCERA ® y otras eritropoyetinas (EPO) en la sangre. La técnica, utilizando SARCOSYL-PAGE, ha específicamente una mayor sensibilidad para MIRCERA, pero no altera las características de rendimiento de SDS-PAGE para detectar EPO otros. Los detalles de este estudio, financiado por una beca de la Agencia Mundial Antidopaje (AMA), aparecen en la última edición de la prueba de la droga y el análisis publicado por Wiley-Blackwell.

MIRCERA (metoxi-polietilenglicol epoetina beta), un pegilado EPO, es una proteína sintética que ayuda al cuerpo a producir glóbulos rojos y se usa para tratar la anemia causada por una enfermedad renal. El fármaco es fabricado por Hoffmann-La Roche y sólo está disponible fuera de la debido a una violación a las patentes de Amgen en los productos recombinantes de la EPO y los procesos de EE.UU.. En el pasado, se han utilizado EPO off-label como agentes dopantes por los atletas para mejorar la resistencia en los deportes como el ciclismo, carreras de larga distancia, y el remo. La AMA ha prohibido el uso de EPO, como MIRCERA, en todos los deportes competitivos.

"La detección del dopaje con EPO recombinante es uno de los temas más desafiantes en el control antidopaje", dijo el Dr. Christian Reichel de los laboratorios de Seibersdorf en el Instituto Austriaco de Tecnología (IAT) y autor principal del estudio. Dr. Reichel y sus colegas obtuvieron muestras de sangre de cuatro voluntarios sanos como parte del estudio. Cada participante recibió una dosis única de cada sustancia EPO (NeoRecormon (66 UI / kg), Dynepo (35 UI / kg), y MIRCERA (50 @ g)). Las muestras fueron recolectadas durante un mínimo de 14 días (NeoRecormon, Dynepo) o hasta 42 días después de la inyección en el caso de MIRCERA.

Los investigadores utilizaron una serie de dilución doble de Dynepo (0,09 ng a 0,7 pg), NESP (0,07 ng a 0,5 pg), y MIRCERA (0,4 a 3,0 ng pg para comparar la sensibilidad de la SDS-PAGE (dodecil sulfato de sodio-gel de poliacrilamida electroforesis) para la detección de MIRCERA por Western Blot. La intensidad de las bandas de Dynepo y NESP disminuyó gradualmente de acuerdo a la disminución de su concentración, pero no un comportamiento similar se observó para las bandas de MIRCERA. "Suponíamos de los experimentos que la alteración de Western Blot rendimiento de MIRCERA se debe a su PEGilación (tratamiento con polietilenglicol para obtener un efecto de acción prolongada de la proteína), "señaló el Dr. Reichel.

PEG de diferentes masas moleculares medios (PEG 1500, 2000, 8000, 20000, 35000) fueron separados por SDS-PAGE y se visualizaron con un método de tinción de PEG-específicos. Debido a un limitado poder de solubilización de SDS, PEG - independientemente de su tamaño molecular - se encontró que migran como bandas anchas y se unta en SDS-PAGE. Teniendo en cuenta los resultados de los investigadores la hipótesis de que la disminución de la sensibilidad de MIRCERA en Western blots se debió a un problema de solubilidad de SDS-base de MIRCERA de PEG-parte.

Para resolver el problema primeras investigaciones utilizaron un detergente con mayor poder de solubilización de las piquetas de SDS que no mejoró la forma de banda de MIRCERA. Luego, los investigadores utilizan SARCOSYL o (SAR)-PAGE con excelentes resultados en Western blots por resolver MIRCERA en una banda fuerte y al mismo tiempo mantener la resolución de rhEPOs y uhEPO en el nivel de rendimiento de SDS-PAGE. Los autores encontraron que "no era vinculante SARCOSYL al glicol de polietileno y fue dejando los PEG en su estado nativo sin carga." El rediseño de SDS-PAGE mediante el intercambio de la SDS para SARCOSYL en la muestra y en funcionamiento buffers resuelto el problema.

"En el pasado, tenía que haber cuatro métodos para detectar sustancias prohibidas. Nuestro método permite a los investigadores para detectar EPO CERA, y otras con sólo un único método", confirmó el Dr. Reichel.

Fuente: Wiley-Blackwell