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Une alternative plus sûre à la thérapie génique expérimentale contre l'infection à VIH

La technique indique une demande de règlement potentielle plus sûre et plus simple de VIH

Les scientifiques au The Scripps Research Institute ont découvert une méthode étonnant simple et sûre pour perturber les gènes spécifiques dans des cellules. Les scientifiques ont mis en valeur le potentiel médical de la technique neuve en expliquant son utilisation comme alternative plus sûre à une thérapie génique expérimentale contre l'infection à VIH.

« Nous avons prouvé que nous pouvons modifier les génomes des cellules sans pannes qui ont été longtemps liées aux techniques traditionnelles de thérapie génique, » avons dit Carlos supérieur de l'étude l'auteur F. Barbas III, qui est le professeur de Janet et de Keith Kellogg II de la biologie moléculaire et de la chimie au The Scripps Research Institute.

La technique neuve, rapportée dans des méthodes de nature le 1er juillet 2012, utilise les protéines de nucléase (ZFN) de doigt à zinc, qui peuvent gripper et couper l'ADN à l'emplacement avec précision défini dans le génome. ZFNs entrent dans l'utilisation répandue dans des expériences scientifiques et des demandes de règlement potentielles de la maladie, mais type sont livrés dans des cellules suivre des méthodes potentiellement risquées de thérapie génique.

Les scientifiques de recherches de Scripps ont simplement ajouté des protéines de ZFN directement aux cellules dans une assiette de laboratoire et ont constaté que les protéines ont croisé dans les cellules et ont rempli leurs fonctionnements de gène-coupe avec la haute performance et le dégât indirect minimal.

« Ce travail retire un goulot d'étranglement important dans l'utilisation efficace des protéines de ZFN comme outil de thérapie génique chez l'homme, » a dit Michael K. Reddy, qui surveille des concessions de mécanisme de transcription aux instituts nationaux de l'institut national de santé (NIH) des sciences médicales générales, qui ont aidé des fonds le travail, avec Pioneer Award de NIH d'un directeur. « La droiture de l'approche de M. Barbas's « simplement de » vérifier la notion que ZFNs pourrait posséder une capacité cellule-pénétrante intrinsèque est un testament à sa nature hautement créative et valide davantage son choix en tant que bénéficiaire 2010 de Pioneer Award de NIH d'un directeur. »

Suppositions de interrogation

ZFNs, en mi-1990 s inventé, sont les éléments artificiels faits de deux types de protéine : une structure de « doigt à zinc » qui peut être conçue pour gripper à une courte séquence d'ADN spécifique, et une enzyme de nucléase qui coupera l'ADN à cet accepteur d'une manière dont les cellules ne peuvent pas réparer facilement. La technologie originelle pour préparer les protéines à doigt de zinc de créateur qui sont employées pour diriger des nucleases vers leurs gènes cibles a été la première fois inventée par Barbas au début des années 90.

Les scientifiques avaient supposé que les protéines de ZFN ne peuvent pas croiser des membranes cellulaires, ainsi la méthode normale de la distribution de ZFN a été une technique de thérapie génique utilisant un virus relativement inoffensif pour transporter un gène du créateur ZFN dans des cellules. Une fois à l'intérieur, le gène de ZFN commence à produire les protéines de ZFN, qui recherchent et détruisent leur gène cible dans l'ADN cellulaire.

Un risque de l'approche de thérapie génique est que si le virus n'est pas a ADN-régulier viral rétrovirus-peut finir être comporté fait au hasard dans l'ADN cellulaire, perturbant un gène précieux tel qu'un gène suppresseur de tumeur. Un autre risque avec cette méthode de la distribution est que les gènes de ZFN finiront produire trop de protéines de ZFN, ayant pour résultat un numéro élevé de « hors circuit-objectif » ADN coupe. « L'approche virale de la distribution concerne beaucoup de dégâts de hors circuit-objectif, » a dit Barbas.

Dans l'étude neuve, Barbas et ses collègues se sont mis à trouver une méthode plus sûre de la distribution de ZFN qui n'a pas comporté l'introduction des virus ou de tout autre matériel génétique dans des cellules. Ils ont expérimenté au commencement avec les protéines de ZFN qui transportent les segments supplémentaires de protéine pour les aider pour pénétrer des membranes cellulaires, mais ont trouvé ces ZFNs modifié dur pour produire en quantité utile. Éventuellement, les scientifiques ont identifié que les segments de doigt à zinc de ZFNs normal ont des propriétés qui pourraient permettre aux protéines d'obtenir par des membranes cellulaires sur leurs propres moyens.

« Nous avons essayé de travailler avec ZFNs non modifié, et, il était facile les produire et les cellules présentées bien efficacement, » Barbas a dit.

Stratégie neuve contre le VIH

Ensuite, l'équipe montrée comment la technique neuve pourrait être employée dans une stratégie basée sur ZFN contre l'infection à VIH.

Le rétrovirus Sida-entraînant infecte normalement des cellules de T par l'intermédiaire d'un récepteur extérieur à cellule T CCR5 appelé, et retirer ce récepteur rend des cellules de T de haute résistance à l'infection à VIH. En 2006, un patient de VIH à Berlin a détruit tous les signes d'infection peu après réception d'une greffe de moelle osseuse pour traiter sa leucémie d'un donneur avec une variante du gène CCR5 cette des résultats dans l'expression inférieure du récepteur. La perturbation du gène CCR5 en cellules de T avec un traitement basé sur ZFN pourrait pouvoir reproduire cet effet spectaculaire.

« L'idée est de protéger certaines des cellules de T du patient contre le VIH, de sorte que le système immunitaire reste assez intense éventuel pour éliminer l'infection, » a dit Barbas.

Une thérapie génique qui emploie ZFNs pour perturber les gènes CCR5 dans des cellules de T et des reinfuses les cellules de T modifiées dans des patients est actuel dans les tests cliniques. Barbas et son équipe ont prouvé qu'ils pourraient réaliser le même effet avec leur méthode plus simple de la ZFN-distribution. Ils ont ajouté des protéines de ZFN directement aux cellules de T humaines dans une boîte de Pétri et ont constaté que dans des heures, une part significative de cellules ZFN-traitées révélées de fortes diminutions d'activité de gène CCR5.

Après plusieurs applications de ZFNs, facilitées par une méthode de refroidissement spéciale qui améliore la capacité des protéines d'obtenir en travers des membranes cellulaires, les scientifiques pouvaient inactiver les gènes CCR5 avec un rendement rapprochant cela de l'approche basée sur traitement de gène, Barbas a dit.

L'approche neuve a également semblé être plus sûre. Une méthode basée sur ADN l'équipe employée pour la comparaison ou les méthodes basées sur viral rapportées dans la littérature par d'autres a fini vers le haut de produire ZFNs pendant jusqu'à plusieurs jours, endommageant une importante quantité hors circuit-objectif ADN. Mais les protéines directement livrées de ZFN ne sont restées intactes dans des cellules que durant quelques heures seulement, endommageant minimal hors circuit-objectif.

« À un certain emplacement de hors circuit-objectif où l'approche de thérapie génique endommage fréquemment, nous n'avons vu aucun dégât du tout de cette technique neuve, » a dit Barbas.

Espoir pour « les usines minuscules » de la santé

L'équipe a vérifié sa technique directe de la ZFN-distribution avec un grand choix d'autres types de cellules et a constaté que cela fonctionne avec en particulier la haute performance en cellules humaines de « fibroblaste » de peau. Les chercheurs maintenant travaillent aux traitements avancés dans lesquels ils moissonnent de tels fibroblastes des patients et reprogramment les configurations de l'expression du gène des cellules de sorte qu'ils deviennent effectivement des cellules souche. Ces cellules souche induites peuvent alors être modifiées utilisant ZFNs et d'autres techniques de génome-retouche. Une fois reinfused dans un patient, elles peuvent produire des millions de cellules thérapeutiques de progéniture au-dessus de longues périodes.

De telles techniques peuvent un jour être employées pour traiter un tableau immense des maladies. Barbas, qui avait développé les stratégies anti-CCR5 pour plus qu'une décennie, veut commencer par un traitement basé sur ZFN qui perturbe le gène CCR5 en cellules souche hématopoïétiques. Ces cellules souche sang-cellule-effectuantes, reinfused dans un patient de VIH, deviendraient les usines minuscules pour produire les cellules de T VIH-résistantes.

« Même un nombre restreint de cellules souche qui transportent cette caractéristique de VIH-résistance pourraient finir remonter complet une population à cellule T originelle et vulnérable du patient, » il a dit.

Les autres auteurs du papier, « ont visé le coup de grâce de gène par la distribution directe des protéines de ZFN, » sont le premier Thomas Gaj auteur, et le Jing Guo, le Yoshio Kato, et le Shannon J. Sirk, tous les membres du laboratoire de Barbas pendant l'étude.