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Alternativa mais segura à terapia genética experimental contra a infecção pelo HIV

A técnica aponta a um tratamento mais seguro, mais simples do potencial VIH

Os cientistas no The Scripps Research Institute descobriram um método surpreendentemente simples e seguro interromper genes específicos dentro das pilhas. Os cientistas destacaram o potencial médico da técnica nova demonstrando seu uso como uma alternativa mais segura a uma terapia genética experimental contra a infecção pelo HIV.

“Nós mostramos que nós podemos alterar os genomas das pilhas sem os problemas que têm sido ligados por muito tempo às técnicas tradicionais da terapia genética,” dissemos Carlos superior do estudo o autor F. Barbas III, que é o professor de Janet e de Keith Kellogg II da biologia molecular e da química no The Scripps Research Institute.

A técnica nova, relatada em métodos da natureza o 1º de julho de 2012, emprega as proteínas da nuclease do dedo (ZFN) do zinco, que podem ligar e cortar o ADN em lugar precisamente definidos no genoma. ZFNs está entrando uso difundido em experiências científicas e em tratamentos potenciais da doença, mas é entregado tipicamente em pilhas usando métodos potencial arriscados da terapia genética.

Os cientistas da pesquisa de Scripps adicionaram simplesmente proteínas de ZFN directamente às pilhas em um prato do laboratório e encontraram que as proteínas se cruzaram nas pilhas e executaram suas funções da gene-estaca com a eficiência elevada e os danos colaterais mínimos.

“Este trabalho remove um gargalo principal no uso eficiente de proteínas de ZFN como uma ferramenta da terapia genética nos seres humanos,” disse Michael K. Reddy, que vigia concessões do mecanismo da transcrição nos institutos nacionais do instituto nacional de saúde (NIH) das ciências médicas gerais, que ajudaram o fundo o trabalho, junto com o Pioneiro Concessão de NIH de um director. “A rectidão da aproximação do Dr. Barbas “simplesmente de” testar a noção que ZFNs poderia possuir uma capacidade pilha-penetrante intrínseca é um testamento a sua natureza altamente criativa e valida mais sua selecção como um receptor 2010 do Pioneiro Concessão de NIH de um director.”

Suposições de questão

ZFNs, em meados de 1990 s inventado, é construções artificiais feitas de dois tipos de proteína: uma estrutura do “zinco-dedo” que possa ser projectada ligar a uma seqüência curto específica do ADN, e uma enzima da nuclease que corte o ADN nesse local obrigatório em uma maneira que as pilhas não possam reparar facilmente. A tecnologia original para fazer o desenhista zincar as proteínas do dedo que são usadas para dirigir nucleases a seus genes do alvo foi inventada primeiramente por Barbas no começo dos 90.

Os cientistas tinham supor que as proteínas de ZFN não podem cruzar as membranas de pilha, assim que o método padrão da entrega de ZFN tem sido uma técnica da terapia genética que emprega um vírus relativamente inofensivo para levar um gene do desenhista ZFN em pilhas. Uma vez para dentro, o gene de ZFN começa produzir as proteínas de ZFN, que procuram e destroem seu gene do alvo dentro do ADN celular.

Um risco da aproximação da terapia genética é que se o vírus não é a ADN-uniforme viral retrovirus-pode terminar acima a incorporação aleatòria no ADN celular, interrompendo um gene valioso tal como um gene do tumor-supressor. Um outro risco com este método da entrega é que os genes de ZFN terminarão acima a produção de proteínas demais de ZFN, tendo por resultado um número alto de ADN do “fora-alvo” corta. “A aproximação viral da entrega envolve muito dano do fora-alvo,” disse Barbas.

No estudo novo, Barbas e seus colegas expor para encontrar um método mais seguro da entrega de ZFN que não envolvesse a introdução de vírus ou do outro material genético em pilhas. Experimentaram inicialmente com as proteínas de ZFN que levam segmentos extra da proteína para os ajudar a penetrar as membranas de pilha, mas encontraram este ZFNs alterado duro produzir em quantidades úteis. Eventualmente, os cientistas reconheceram que os segmentos do zinco-dedo de ZFNs ordinário têm as propriedades que puderam permitir as proteínas de obter através das membranas de pilha no seus próprios.

“Nós tentamos trabalhar com ZFNs unmodified, e, eram fáceis de produzir e pilhas incorporadas bastante eficientemente,” Barbas disse.

Estratégia nova contra o VIH

Em seguida, a equipe mostrada como a técnica nova poderia ser usada em uma estratégia ZFN-baseada contra a infecção pelo HIV.

O retrovirus decausa contamina normalmente pilhas de T através de uma superfície CCR5 chamado receptor do t cell, e remover este receptor faz pilhas de T altamente resistentes à infecção pelo HIV. Em 2006, um paciente de VIH em Berlim perdeu todos os sinais da infecção logo após ter recebido uma transplantação da medula para tratar sua leucemia de um doador com uma variação do gene CCR5 essa resultados na baixa expressão do receptor. Interromper o gene CCR5 em pilhas de T com uma terapia ZFN-baseada pôde poder reproduzir este efeito dramático.

“A ideia é proteger algumas das pilhas de T do paciente do VIH, de modo que o sistema imunitário permaneça forte bastante finalmente limpar para fora a infecção,” disse Barbas.

Uma terapia genética que use ZFNs para interromper os genes CCR5 em pilhas de T e em reinfuses as pilhas de T alteradas em pacientes está actualmente nos ensaios clínicos. Barbas e sua equipe mostraram que poderia conseguir o mesmo efeito com seu método mais simples da ZFN-entrega. Adicionaram proteínas de ZFN directamente às pilhas de T humanas em um prato de cultura e encontraram que dentro das horas, uma fracção significativa das pilhas ZFN-tratadas mostradas reduções afiadas na actividade de gene CCR5.

Após diversas aplicações de ZFNs, ajudadas por um método refrigerando especial que melhorasse a capacidade das proteínas para obter através das membranas de pilha, os cientistas podiam neutralizar os genes CCR5 com uma eficiência que aproxima aquela da aproximação terapia-baseada gene, Barbas disse.

A aproximação nova igualmente pareceu ser mais segura. Um método ADN-baseado a equipe usada para a comparação ou os métodos viral-baseados relatados na literatura por outro terminou acima de produzir ZFNs por até diversos dias, causando uma quantidade significativa de dano do ADN do fora-alvo. Mas as proteínas directamente entregadas de ZFN permaneceram intactos dentro das pilhas por somente algumas horas, causando dano mínimo do fora-alvo.

“Em alguns lugar do fora-alvo onde a aproximação da terapia genética causa freqüentemente dano, nós não vimos nenhum dano de todo desta técnica nova,” disse Barbas.

Esperança para “fábricas minúsculas” de saúde

A equipe testou sua técnica directa da ZFN-entrega com uma variedade de outros tipos da pilha e encontrou que trabalha com particularmente eficiência elevada em pilhas humanas do “fibroblasto” da pele. Os pesquisadores agora estão trabalhando nas terapias avançadas em que colhem tais fibroblasto dos pacientes e reprogram os testes padrões da expressão genética das pilhas de modo que se transformem eficazmente células estaminais. Estas células estaminais induzidas podem então ser alteradas usando ZFNs e outras técnicas deedição. Quando reinfused em um paciente, podem produzir milhões de pilhas terapêuticas da descendência durante longos período.

Tais técnicas podem um dia ser usadas para tratar uma disposição vasta de doenças. Barbas, que tem desenvolvido as estratégias anti-CCR5 para mais do que uma década, quer começar com uma terapia ZFN-baseada que interrompa o gene CCR5 em células estaminais hematopoietic. Estas células estaminais defactura, reinfused em um paciente de VIH, transformar-se-iam fábricas minúsculas para produzir pilhas de T VIH-resistentes.

“Mesmo um pequeno número de células estaminais que levam esta característica da VIH-resistência poderiam terminar acima completamente a substituição de uma população de célula T original e vulnerável do paciente,” disse.

Os outros autores do papel, “visaram o KO do gene pela entrega directa de proteínas de ZFN,” são primeiro Thomas Gaj autor, e Jing Guo, Yoshio Kato, e Shannon J. Sirk, todos os membros do laboratório de Barbas durante o estudo.