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A combinação de NASBA e de qPCR do tempo real detecta o aspergillosis com precisão 100%

O aspergillosis invasor da infecção fungosa (IA) pode ser risco de vida, especialmente nos pacientes cujos os sistemas imunitários são enfraquecidos pela quimioterapia ou por drogas immunosuppressive. Apesar da necessidade crítica para a detecção atempada, IA permanece difícil de diagnosticar. Um estudo no jornal de diagnósticos moleculars comparou três testes de diagnóstico e encontrou que a combinação de ácido nucleico seqüência-baseou a amplificação (NASBA) e PCR quantitativo do tempo real (qPCR) detecta o aspergillosis com precisão 100%.

IA é causado pelo fumigatus do aspergilo do fungo, que é considerado por muitos patologistas ser o molde o mais prejudicial do mundo. “Os métodos diagnósticos tradicionais, tais como a cultura e a histopatologia de tecidos contaminados, frequentemente não detectam o aspergilo,” YUN Xia do investigador principal dos comentários, PhD, do primeiro hospital afiliado da universidade médica de Chongqing, Chongqing, China.

Neste estudo retrospectivo, os cientistas avaliaram o desempenho diagnóstico de dois ensaios da amplificação do ácido nucleico (qPCR e NASBA) e de um método de detecção do antígeno (ensaio enzima-ligado galactomannan da imunoabsorção [GM-ELISA]) que usa as amostras de sangue recolhidas de 80 pacientes no risco elevado de IA. Dos 80 pacientes, 42,5% tinham provado ou IA provável. Os pacientes vieram dos cuidados intensivos, da hematologia, da neurologia, da nefrologia, da geriatria, e dos outros departamentos do hospital.

Os testes foram avaliados única e na combinação. Individualmente, NASBA teve a sensibilidade a mais alta (76,47%) visto que o qPCR ofereceu a especificidade a mais alta (89,13%). NASBA igualmente era o teste que esse melhor indicou que um paciente não teve a infecção (valor com carácter de previsão negativo). NASBA e o qPCR cada um tiveram um deslocamento predeterminado alto de Youden, uma medida da eficácia de um marcador diagnóstico.

Combinar os testes melhorou os resultados. A combinação de NASBA e de qPCR conduziu à especificidade 100% e ao valor com carácter de previsão positivo de 100% (a probabilidade que os assuntos têm verdadeiramente a infecção).

“Porque cada teste tem vantagens e desvantagens, uma combinação de testes diferentes pode poder fornecer o melhor valor diagnóstico do que é fornecido por um único teste, “diz o Dr. Xia. A combinação de NASBA e de qPCR deve ser útil em excluir IA nos casos suspeitos, assim reduzindo o sofrimento e a despesa para pacientes immunocompromised. Por outro lado, a combinação de NASBA e de qPCR poderia ser mais apropriada para selecionar os pacientes suspeitados da infecção, porque este ensaio teve a sensibilidade a mais alta.”

Os autores notam que NASBA oferece as vantagens da amplificação rápida (90 minutos) e da operação simples com o baixo custo do instrumento comparado com o qPCR e o GM-ELISA. Advertem que embora GM-ELISA seja usado extensamente e rotineiramente para o diagnóstico do aspergillosis, este estudo indica que teve a baixa sensibilidade (52,94%) com a especificidade razoável (80,43%), fazendo lhe o “inferior a NASBA e a qPCR.”

O molde do fumigatus do A. é ubíquo no ambiente e é encontrado na matéria de deterioração da planta. Para a exposição saudável dos indivíduos ao fungo pode ser inconsequente, mas pode causar a morbosidade significativa e a mortalidade para aquelas com sistemas imunitários comprometidos, incluindo os pacientes que se submeteram a transplantações de órgão ou se avançaram o AIDS. Mesmo os pacientes com prejuízos imunes mais modestos, tais como o diabetes, nutrição deficiente, uso esteróide, ou doença pulmonar, podem tornar-se contaminados severamente. Os sintomas podem incluir a febre, a tosse, a dificuldade que respiram, a dor no peito, as apreensões, e problemas neurológicos focais.

Os critérios para o risco elevado para os níveis incluídos IA do β-D-glucan da elevação (1,3) - (>60 pg/mL), o estado immunocompromised, e uma de seis circunstâncias (o receptor de uma transplantação allogeneic da célula estaminal, de uma doença hematológica, de uma imunodeficiência severa, de um uso prolongado dos corticosteroide, de uma febre ou de uma caixa infiltra a indicação sem resposta aos antibióticos rotineiros, ou radiológica da doença fungosa). Os pacientes não receberam nenhuma terapia antifungosa até depois as amostras de sangue foram recolhidas.

O primeiro teste era a medida do GM, um componente do polisacárido da parede de pilha fungosa, que pode ser liberada no soro e no líquido de lavage broncoalveolar durante a infecção. O GM foi medido usando um jogo disponível no comércio de ELISA (aspergilo de Platelia; Bio-Rad laboratórios, Hercules, CA). Neste estudo, um deslocamento predeterminado do GM (GMI) de 0,5 foi usado.

O segundo teste era um ensaio do qPCR da extracção e do tempo real do ADN do aspergilo. O ADN foi extraído do plasma usando jogo do sangue de QIAamp um mini (Qiagen, Hilden, Alemanha). O ADN refinado foi amplificado então por um ensaio género-específico do qPCR do aspergilo usando a química verde de SYBR e pelas primeiras demão que visam o gene do rRNA 28S. O limite de detecção mais baixo foi determinado empìrica ser 10 unidades da formação de colónias de conidia do aspergilo pela reacção.

O terceiro teste era uma extracção do RNA do aspergilo e ensaio de NASBA. O RNA total foi extraído do plasma usando um jogo rápido do sangue/da extracção RNA líquido do total da amostra (BioTeke, Pequim, China). Um específico altamente conservado da região do rRNA 18S para o género do aspergilo foi escolhido como o alvo da detecção. Foi amplificado então usando um par de primeiras demão. O controle vazio, o controle negativo (RNA extraído dos pacientes sem infecção do aspergilo) e o controle positivo (RNA extraído do aspergilo na cultura pura) foram incluídos em cada um executado.