Utilisant l'élutriation centrifuge et la cytométrie de flux pour répondre à des questions biologiques : une entrevue avec Peter Lopez

Prof. Peter LopezTHOUGHT LEADERS SERIES...insight from the world’s leading experts

Quelles sont les questions biologiques principales que vous avez pu répondre par l'utilisation de la cytométrie de flux ?

La cytométrie de flux, la mesure des caractéristiques cellulaires variées car elles traversent un dispositif de mesure, a tant d'applications qu'il est difficile de savoir où commencer.

J'ai été impliqué avec l'application des techniques de cytométrique de flux au préexamen de cancer cervical, la purification de différents chromosomes de souris, l'identification des cellules subissant l'apoptose, la purification de cellule souche, l'étude du fonctionnement de récepteur des lymphocytes T et de la biologie de lymphocyte T, le HIV/SIDA, et les applications variées liées à la biologie de cancer.

Comment l'utilisation de la cytométrie de flux a-t-elle changé depuis que vous avez commencé à travailler dans le domaine en 1977 ?

Les cytometers de flux pendant les années 70 étaient relativement rares, et ont exigé d'un spécialiste spécifique de faire fonctionner, mettre à jour, et interpréter les caractéristiques rassemblées.

Le nombre de mesures qui pourraient être effectuées à partir de chaque cellule ont été limitées moins qu'une poignée. Les instruments ont également analysé des cellules à ce que nous considérons maintenant les régimes lents de débit (cellules <5,000 par seconde).

Des cytometers de flux ont été type installés dans des installations de moyen partagé (faisceaux), de sorte que beaucoup de laboratoires aient pu tirer bénéfice de l'instrumentation et des compétences. Ces instruments étaient également tout à fait grands et chers, ainsi l'utilisation de la cytométrie de flux a été limitée à quelques centres de formation générale.

Aujourd'hui nous voyons les cytometers de flux qui ont énormément amélioré le débit (analyse de 70.000 cellules/en second lieu), avec la capacité de rassembler plus de 20 paramètres.

Le mariage de la cytométrie de flux et de la spectrométrie de masse est une nouveauté passionnante permettant à bien plus de paramètres de s'analyser que la cytométrie de flux traditionnelle.

Le remontage de la technique de marquage fluorescente omniprésente employée en cytométrie de flux avec des isotypes en métal pour marquer des cellules promesses la capacité de trouver des sous-ensembles de cellules résolus avec 30 paramètres ou plus, bien que cette technologie de CyToF exclue trier de cellules.

Coutre de Beckman

Crédit d'image : Coutre de Beckman

Un autre développement est l'introduction des cytometers moins complexes et faciles à utiliser, avec l'utilisation maintenant vue en dehors de du réglage scolaire de faisceau.

Des cytometers de flux sont maintenant par habitude vus dans l'industrie pharmaceutique, en agriculture et science des plantes, à la fabrication, dans la surveillance de qualité de nourriture et de l'eau, chez la détermination de sexe animale, en surveillant le milieu marin, en microbiologie, avec une grande application importante dans la diagnose humaine.

Comment le coutre de Beckman a-t-il supporté votre travail ?

L'instrumentation de cytométrique de flux de coutre de Beckman a été dans mon laboratoire depuis le milieu des années 80. Plus récent BC a été très de support de nos études expliquer les avantages de l'intégration de l'élutriation centrifuge dans le laboratoire de cytométrie de flux.

Trieuse de cellules de MoFlo pdc à l

Trieuse de cellules de MoFlo pdc à l'installation de cytométrie de flux de NYULMC. Trieuse ultra-rapide de cellules pour le ramassage en vrac ou le clonage unicellulaire des populations cellulaires épurées. Crédit d'image : Coutre de Beckman

Quelle est élutriation centrifuge et que sont-ils les avantages comparés à d'autres techniques de purification de cellules ?

L'élutriation centrifuge est une technologie inventée par Charles Lindberg (le pilote célèbre) pendant les années 1930, et permet la séparation des cellules selon leur vitesse de sédimentation d'une mode continue utilisant un rotor spécialisé de centrifugeuse.

Ce rotor permet le chargement des cellules dans la chambre de rotation de décanteur, et puis permet l'introduction d'un tampon opposant le sens de la force centrifuge, fractionnant de ce fait des cellules.

Ceci a l'avantage important de produire les populations épurées des cellules sans besoin chimiquement de traiter ou de marquer des cellules, et peut produire un grand nombre de cellules épurées plus rapides que la cytométrie de flux. L'élutriation centrifuge est également une procédure douce.

Les systèmes de décanteur peuvent-ils être maintenus stériles ? Pourquoi est-ce que c'importante pour répondre est certaines questions biologiques ?

Oui, le système entier d'élutriation peut être stérilisé in situ. Des échantillons de cellules peuvent être préparés, introduits et rassemblés du décanteur dans un module stérile de sécurité biologique, mettant à jour la stérilité de cellules. C'est important puisque la purification des cellules est souvent la première étape dans une série d'analyses biologiques qui concernent la culture cellulaire.

Une utilisation bien établie d'élutriation est de synchroniser des cellules dans la même phase de cycle cellulaire, et ces cellules sont alors mises dans la culture cellulaire ou d'autres systèmes où des effets de la drogue peuvent être vérifiés, et la stérilité est essentielle dans ces systèmes.

Là où les échantillons sont prétraités pour l'élimination de petites saletés avant de trier, toutes les procédures doivent mettre à jour la stérilité de cellules, y compris l'élutriation et trier de cellules.

Quels instruments de coutre de Beckman utilisez-vous dans votre laboratoire et pourquoi ?

Tous les systèmes de coutre de Beckman en service dans mon laboratoire sont des systèmes solides de cheval de labour que nous comptons en circuit pour la sortie cohérente quotidienne.

Nous naturellement employons des centrifugeuses de coutre de Beckman, l'élément de benchtop d'Allegra X-12R et l'élément étage-restant d'Avanti J-20 qui pilote notre système d'élutriation du contre-courant JE-5.0. Toutes ces centrifugeuses sont les instruments bien construits et stables.

Pour la détermination de viabilité de cellules et de taille de cellules, nous avons un coutre ViCell de Beckman. La viabilité et la taille de cellules sont des déterminations essentielles avant l'élutriation et aussi utile en cytométrie de flux.

Pour la cellule triant un de nos systèmes de cheval de labour dans la trieuse ultra-rapide de cellules de MoFlo XDP de coutre de Beckman. Nous sommes en cours de mettre le cytometer de flux de couleur de CytoFLEX 13 de coutre de Beckman dans le flux de travail de notre laboratoire.

Comment trier de cellules de cytométrie de flux compare-t-il à la séparation magnétique de talon et à l'élutriation centrifuge ?

Chaque technique a ses forces et faiblesses. La purification de cellules par cytométrie de flux est inégalée dans sa capacité d'épurer beaucoup de populations simultanément (jusqu'à 6 populations utilisant le coutre MoFlo Astrios de Beckman), avec la capacité de caractériser ces sous-populations pour la purification utilisant 20 paramètres ou plus.

Puisque chaque cellule individuelle doit être caractérisée pour l'analyse et trier, la cytométrie de flux a actuel une « vitesse limite », pour un résultat le nombre de cellules qui peuvent être épurées ne sont pas au même niveau que l'élutriation ou le désespoir magnétique de talon. Le niveau de grande pureté des cellules triées utilisant la cytométrie de flux-- pureté jusqu'à de 99%-- est également inégalé par d'autres techniques.

La séparation magnétique de talon est une technique facile à utiliser, et elle est employée dans de nombreux cas avant la cellule de cytométrique de flux triant pour préenrichir des échantillons pour un type désiré de cellules. Une fois utilisé pour prétraiter des échantillons devant la cellule triant, il y a un gain de temps, particulièrement en traitant un grand nombre de cellules.

Les forces des deux technologies peuvent être fusionnées. Il peut également être employé comme technique autonome de purification, mais peut seulement séparer des cellules basées sur une caractéristique -- ce n'est pas un système multiparametric.

L'élutriation centrifuge partage certains des mêmes avantages et faiblesses de la séparation magnétique de talon, mais depuis la vitesse de sédimentation, qui est dominée par taille de cellules, est le facteur distinctif dans la purification, il peut fournir l'enrichissement des cellules dans étapes variées du cycle cellulaire, qui n'est pas facilement accompli utilisant la séparation magnétique. Ce type d'application peut être exécuté utilisant la cellule de cytométrique de flux triant, bien qu'à un débit plus lent.

Très un avantage important d'élutriation centrifuge si comparé à la cytométrique de flux ou aux méthodes magnétiques de purification est que les cellules pour l'élutriation centrifuge n'ont besoin d'aucune demande de règlement chimique ou à l'opération de marquage. C'est un avantage énorme pour synchroniser des populations cellulaires où la famine de sérum ou le blocage de cycle cellulaire de produit chimique n'est pas désirable.

Quelles limitations doivent toujours être surmontées ?

L'élutriation centrifuge est une technique où l'expérience joue un rôle majeur, qui le rend assimilé à la cytométrie de flux à cet égard. Comme vu dans les tendances actuelles pour des constructeurs de cytometer de flux, l'établissement des systèmes qui peuvent être employés par les personnes moins expérimentées serait avantageux.

Une autre limitation est la capacité de traiter des numéros de petite cellule de moins que million de cellules. Avoir de plus petits systèmes spécialisés d'élutriation aiderait à résoudre cette limitation.

Que pensez-vous les futures prises à l'utilisation de l'élutriation centrifuge et à la cytométrie de flux dans le cadre de répondre à des questions biologiques ?

Une grande partie du travail publié avec l'élutriation centrifuge prouve qu'il a l'utilisation dans le syncronization des cellules ainsi que la purification de certaines populations cellulaires d'une population commençante hétérogène.

Nous avons expliqué la capacité de l'élutriation de réduire la quantité de petites saletés actuelle dans beaucoup de préparations de cellules destinées pour trier de cellules. Ceci ajoutera une application neuve au répertoire d'élutriation, pour être employé comme opération de prétraitement avant trier de cellules.

Les préparations effectuées à partir du matériau primaire comme des tumeurs dissociées, utilisées dans l'étude des lymphocytes d'infiltration de tumeur peuvent contenir un grand nombre de petites saletés qui peuvent la rendre dure pour recenser des cellules d'intérêt et pour rallonger le tri nécessaire de cellules de temps. En accouplant une liquidation de prétraitement des échantillons saleté saleté San améliorez le rendement en aval de trieuse de cellules.

Le démontage de petites saletés ou de tout autre matériau non désiré a le potentiel de fournir à des instruments de CyTOF un échantillon plus propre et d'améliorer le rendement dans ce flux de travail également. Nous vérifierons ceci dans de futures études collaboratives.

Applications possibles de cytométrie de flux

Crédit d'image : Coutre de Beckman

Où peuvent les lecteurs trouver plus d'informations ?

La meilleure source unique de relatif à l'information à la cytométrie de flux est « cytométrie de flux pratique », par M. Howard Shapiro, maintenant en sa 4ème édition. Le coutre de Beckman fournit une tige à cette référence pour le visionnement en ligne sur leur site Web. http://www.coulterflow.com/bciflow/practical/book/index.html

Au sujet de Peter Lopez

Peter Lopez a été impliqué dans l'inducteur de la cytométrie de flux depuis 1977 et a l'expérience dans le management de laboratoire de moyen partagé, l'exécution de cytometer, le développement d'instrument, le plan d'expérience, et une grande variété d'applications de cytométrique.

Peter a managé élevé-couronné de succès et les installations respectées de faisceau de cytométrique et de représentation de flux au Fox chassent l'institut de cancer, Dana-Farber Cancer Institute, le centre de recherche de SIDA de diamant d'Aaron, et actuel au centre médical de NYU Langone.

Peter a une expérience à commande manuelle avec le fonctionnement et le dépannage de l'instrumentation de tous les constructeurs importants de cytometer, ainsi que l'instrumentation expérimentale de prototype.

Peter est remarqué avec la configuration de laboratoire, la validation et les pratiques pour trier le matériau infectieux. Il est impliqué dans la théorie de mise au point de programmes éducative et l'application de cytométrique de revêtement.

Peter a été le président des sociétés professionnelles régionales tels à MetroFlow (groupe d'utilisateurs de cytométrie de New York/New Jersey), aux directeurs régionaux du nord-est de faisceau des sciences de la vie (NERLSCD), et actuel sert des conditions de conseiller d'ISAC ainsi qu'est un membre du conseil d'exécutif d'ABRF. Peter sert sur le nombreux universitaire et les comités consultatifs industriels.

Les intérêts actuels de Peter comprennent redéfinir le rôle du faisceau de cytométrie de flux dans un modèle distribué d'emplacement, ajoutant des technologies neuves telles que l'élutriation centrifuge dans le catalogue de service de faisceau de cytométrie de flux, ainsi que des méthodes pour vérifier la reproductibilité de caractéristiques et renforçant la position des laboratoires de faisceau comme centre pour l'adhérence des pratiques au centre de formation générale.

Les sciences de la vie de coutre de Beckman - Automatique-Cellulaires et protéomiqueAu sujet du coutre de Beckman

Pour l'emplacement mondial et les numéros de téléphone du bureau du coutre de Beckman, visitez s'il vous plaît « nous contactent » chez www.beckmancoulter.com.

En mi-1950 s introduit, le principe de coutre est devenu la fondation d'une industrie répondant au besoin d'instruments robotisés de comptage de cellules. L'industrie développée dans trois actes, comme Wallace H. Coulter et son frère Joseph R. Coulter, Jr., a développé l'idée simple de réussir des cellules par une ouverture de détection.

Dans la Loi I, le désir de Wallace d'automatiser la numération des globules rouges courante a mené à une idée simple, à la définition du principe de coutre, à son brevetage, à son acceptation par les instituts de la santé nationaux, et à sa description à une conférence nationale.

Dans la Loi II, les frères de coutre ont adressé les caractères pratiques d'un instrument commercial et d'une association d'entreprises pour supporter sa fabrication et vente.

Dans la Loi III, un effort de recherche grand développé concernant des erreurs volumétriques provenant des caractéristiques fonctionnelles de l'ouverture de détection, et l'organisme croissant des frères' ont trouvé des solutions permettant l'introduction des analyseurs de plus en plus robotisés d'hématologie. Aujourd'hui l'industrie prospère, avec plusieurs participants.

Le coutre de Beckman offre une gamme des outils de caractérisation de particules comprenant :

  • Analyseurs de dimension particulaire de diffraction de laser
  • COUTRE COUNTER® de Multisizer™
  • Potentiel de Zeta et analyseur submicronique de dimension particulaire
  • Surface et analyseur de taille de pore

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