Facendo uso di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga e di citometria a flusso per rispondere alle domande biologiche: un'intervista con Peter Lopez

Prof. Peter LopezTHOUGHT LEADERS SERIES...insight from the world’s leading experts

Che cosa sono le domande biologiche principali che avete potuto rispondere con l'uso di citometria a flusso?

La citometria a flusso, la misura di varie caratteristiche cellulari poichè attraversano uno strumento di misura, ha tante applicazioni che è duro conoscere dove cominciare.

Sono stato coinvolgere con l'applicazione delle tecniche cytometric di flusso a prevagliatura del cancro cervicale, la depurazione di diversi cromosomi del mouse, l'identificazione delle celle che subiscono il apoptosis, la depurazione della cellula staminale, lo studio sulla funzione di recettore delle cellule t e sulla biologia della cellula T, il HIV/AIDS e le varie applicazioni relative a biologia del cancro.

Come l'uso di citometria a flusso è cambiato da quando avete cominciato a lavorare nel campo nel 1977?

I cytometers di flusso negli anni 70 erano relativamente rari ed hanno richiesto ad uno specialista dedicato di gestire, mantenere ed interpretare i dati raccolti.

Il numero delle misure che potrebbero essere effettuate da ogni cella sono state limitate di meno che una manciata. Gli strumenti egualmente hanno analizzato le celle a cui ora consideriamo come tariffe lente di capacità di lavorazione (celle <5,000 al secondo).

I cytometers di flusso sono stati installati tipicamente negli impianti delle risorse comuni (memorie), di modo che molti laboratori hanno potuto trarre giovamento dalla strumentazione e dalla competenza. Questi strumenti erano egualmente abbastanza grandi e costosi, in modo dall'uso di citometria a flusso è stato limitato ad alcuni centri accademici.

Oggi vediamo i cytometers di flusso che hanno migliorato notevolmente la capacità di lavorazione (un'analisi di 70.000 celle/in secondo luogo), con la capacità di raccolta dei più di 20 parametri.

Il matrimonio di citometria a flusso e di spettrometria di massa è una novità emozionante permettendo che ancor più parametri siano analizzati che la citometria a flusso tradizionale.

La sostituzione della tecnica di contrassegno fluorescente onnipresenta utilizzata nella citometria a flusso con gli isotipi del metallo per contrassegnare le celle promesse la capacità di individuare i sottoinsiemi delle cellule risolti con 30 o più parametri, sebbene questa tecnologia di CyToF precluda l'ordinamento delle cellule.

Coltro di Beckman

Credito di immagine: Coltro di Beckman

Un altro sviluppo è l'introduzione dei cytometers meno complessi e di facile impiego, con uso ora veduto fuori della regolazione accademica di memoria.

I cytometers di flusso ora sono veduti ordinariamente nell'industria farmaceutica, in agricoltura ed agronomia, nella fabbricazione, nel video di qualità dell'acqua e dell'alimento, nella determinazione del sesso animale, nel video dell'ambiente marino, in microbiologia, con una grande applicazione importante nei sistemi diagnostici umani.

Come il coltro di Beckman ha supportato il vostro lavoro?

La strumentazione cytometric di flusso del coltro di Beckman è stata nel mio laboratorio dai metà di anni 80. Più recentemente BC è stata molto complementare dei nostri studi dimostrare i vantaggi dell'integrazione di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga nel laboratorio di citometria a flusso.

Visore inclinato per diapositive delle cellule di MoFlo CDP alla funzione di citometria a flusso di NYULMC. Visore inclinato per diapositive ad alta velocità delle cellule per la raccolta in blocco o la clonazione unicellulare delle popolazioni depurative delle cellule.

Visore inclinato per diapositive delle cellule di MoFlo CDP alla funzione di citometria a flusso di NYULMC. Visore inclinato per diapositive ad alta velocità delle cellule per la raccolta in blocco o la clonazione unicellulare delle popolazioni depurative delle cellule. Credito di immagine: Coltro di Beckman

Che cosa è classificazione mediante veicolo fluido centrifuga e che cosa sono i vantaggi confrontati ad altre tecniche di depurazione delle cellule?

La classificazione mediante veicolo fluido centrifuga è una tecnologia inventata da Charles Lindberg (il pilota famoso) negli anni 30 e permette la separazione di celle secondo la loro velocità della sedimentazione ad un modo continuo facendo uso di un rotore specializzato della centrifuga.

Questo rotore permette il carico delle celle nella camera di filatura dell'elutriatore e poi permette l'introduzione di un buffer che si oppone alla direzione di forza centrifuga, quindi frazionante le celle.

Ciò ha il vantaggio importante della produzione delle popolazioni depurative delle celle senza l'esigenza chimicamente della cura o del contrassegno delle celle e può produrre tantissime celle depurative più veloci della citometria a flusso. La classificazione mediante veicolo fluido centrifuga è egualmente una procedura delicata.

Possono i sistemi dell'elutriatore essere tenuti sterili? Perché è questa importante per la risposta domande biologiche determinate?

Sì, l'intero sistema di classificazione mediante veicolo fluido può essere sterilizzato in situ. I campioni delle cellule possono essere preparati, presentati e raccolti dall'elutriatore in un gabinetto sterile di sicurezza biologica, mantenente la sterilità delle cellule. Ciò è importante poiché la depurazione delle celle è spesso il primo punto in una serie delle analisi biologiche che comprendono la coltura cellulare.

Un uso affermato di classificazione mediante veicolo fluido è di sincronizzare le celle nella stessa fase di ciclo cellulare e queste celle poi sono messe in coltura cellulare o in altri sistemi in cui gli effetti della droga possono essere provati e la sterilità è cruciale in questi sistemi.

Dove i campioni stanno essendo pretrattati per l'eliminazione di piccoli detriti prima dell'ordinamento, tutte le procedure devono mantenere la sterilità delle cellule, compreso classificazione mediante veicolo fluido e l'ordinamento delle cellule.

Quali strumenti del coltro di Beckman utilizzate nel vostro laboratorio e perché?

Tutti sistemi del coltro di Beckman in uso nel mio laboratorio sono sistemi solidi del cavallo di lavoro che contiamo sopra per output coerente quotidiano.

Naturalmente usiamo le centrifughe del coltro di Beckman, sia l'unità del benchtop di Allegra X-12R che l'unità pavimento-stante di Avanti J-20 che determina il nostro sistema di classificazione mediante veicolo fluido di controcorrente JE-5.0. Tutte queste centrifughe sono strumenti ben fatto e stabili.

Per attuabilità delle cellule e la determinazione di dimensione delle cellule, abbiamo un coltro ViCell di Beckman. La dimensione delle cellule e di attuabilità è le determinazioni cruciali prima di classificazione mediante veicolo fluido ed anche utile in citometria a flusso.

Per la cella che ordina uno dei nostri sistemi del cavallo di lavoro nel visore inclinato per diapositive ad alta velocità delle cellule di MoFlo XDP del coltro di Beckman. Siamo nel corso del collocamento del cytometer di flusso di colore di CytoFLEX 13 del coltro di Beckman nel flusso di lavoro del nostro laboratorio.

Come l'ordinamento delle cellule di citometria a flusso confronta alla separazione magnetica della perla ed alla classificazione mediante veicolo fluido centrifuga?

Ogni tecnica ha le sue resistenze e debolezze. La depurazione delle cellule da citometria a flusso è ineguagliata nella sua capacità di depurare simultaneamente molte popolazioni (fino a 6 popolazioni facendo uso del coltro MoFlo Astrios di Beckman), con la capacità di caratterizzare queste sottopopolazioni per depurazione facendo uso di 20 parametri o di più.

Poiché ogni cella determinata deve essere caratterizzata per l'analisi ed ordinare, la citometria a flusso corrente ha “un limite di velocità„, per un risultato il numero delle celle che possono essere depurate non sono allo stesso livello della classificazione mediante veicolo fluido o della disperazione magnetica della perla. Il livello di elevata purezza di celle ordinate facendo uso di citometria a flusso-- purezza di fino a 99%-- è egualmente ineguagliato mediante altre tecniche.

La separazione magnetica della perla è una tecnica di facile impiego ed in molti casi è usata prima della cella cytometric di flusso che ordina per prearricchire i campioni per un tipo desiderato delle cellule. Una volta usato per preelaborare i campioni prima della cella che ordina, c'è un risparmiatore di tempo, particolarmente quando elabora tantissime celle.

Le resistenze di entrambe le tecnologie possono essere fuse. Può anche essere usata come tecnica autonoma di depurazione, ma può separare soltanto le celle basate su una caratteristica - - non è un sistema multiparametric.

La classificazione mediante veicolo fluido centrifuga divide alcune degli stessi vantaggi e debolezze della separazione magnetica della perla, ma dalla velocità della sedimentazione, che è dominata dalla dimensione delle cellule, è il fattore acuto nella depurazione, può fornire l'arricchimento delle celle in varie fasi del ciclo cellulare, che non è compiuto facilmente facendo uso della separazione magnetica. Questo tipo di applicazione può essere eseguito facendo uso della cella cytometric di flusso che ordina, sebbene ad una capacità di lavorazione più lenta.

Un vantaggio molto significativo di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga una volta confrontato sia il punto di contrassegno o il trattamento chimico non richiedono classificazione mediante veicolo fluido centrifuga per le celle che è ai metodi di depurazione magnetici o cytometric di flusso. Ciò è un vantaggio enorme per la sincronizzazione delle popolazioni delle cellule in cui l'inedia del siero o la didascalia del ciclo cellulare del prodotto chimico non è desiderabile.

Che limitazioni ancora devono essere sormontate?

La classificazione mediante veicolo fluido centrifuga è una tecnica dove l'esperienza svolge un ruolo importante, che lo rende simile a citometria a flusso in questo senso. Come si vede nelle tendenze correnti per i produttori di cytometer di flusso, produrre i sistemi che possono essere usati dalle persone meno con esperienza sarebbe utile.

Un'altra limitazione è la capacità di elaborare i piccoli numeri delle cellule di di meno che milione celle. Specializzare i più piccoli sistemi di classificazione mediante veicolo fluido contribuirebbe a risolvere questa limitazione.

Che cosa pensate le tenute future per l'uso di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga e la citometria a flusso nel contesto del rispondere alle domande biologiche?

Gran parte dell'opera pubblicata con classificazione mediante veicolo fluido centrifuga indica che ha utilizzazione in syncronization delle celle come pure nella depurazione delle popolazioni sicure delle cellule da una popolazione cominciante eterogenea.

Abbiamo dimostrato la capacità di classificazione mediante veicolo fluido di diminuire la quantità di piccoli detriti presente in molti preparati delle cellule destinati per l'ordinamento delle cellule. Ciò aggiungerà una nuova applicazione al repertorio di classificazione mediante veicolo fluido, essere usato come punto di lavorazione prima dell'ordinamento delle cellule.

I preparati fatti da materiale primario come i tumori dissociati, utilizzati nello studio dei linfociti di infiltrazione del tumore possono contenere un gran numero di piccoli detriti che possono renderlo duro identificare le celle di interesse ed allungare l'ordinamento necessario delle cellule di tempo. Coppia un cleanup di lavorazione dei campioni carichi di detriti san migliori il risparmio di temi a valle del visore inclinato per diapositive delle cellule.

La rimozione di piccoli detriti o dell'altro materiale indesiderato ha il potenziale di fornire agli strumenti di CyTOF un campione più pulito e del miglioramento del risparmio di temi in quel flusso di lavoro anche. Studieremo questo negli studi di collaborazione futuri.

Applicazioni potenziali di citometria a flusso

Credito di immagine: Coltro di Beckman

Dove possono i lettori trovare più informazioni?

La migliore singola sorgente di attinente all'informazione a citometria a flusso è “citometria a flusso pratica„, dal Dott. Howard Shapiro, ora in sua quarta edizione. Il coltro di Beckman fornisce un collegamento a questo riferimento per la visualizzazione online sul loro sito Web. http://www.coulterflow.com/bciflow/practical/book/index.html

Circa Peter Lopez

Peter Lopez è stato coinvolgere nel campo di citometria a flusso dal 1977 ed ha esperienza nella gestione del laboratorio delle risorse comuni, nel funzionamento di cytometer, nello sviluppo dello strumento, nella progettazione sperimentale ed in un'ampia varietà di applicazioni cytometric.

Peter ha gestito di grande successo ed il flusso rispettato cytometric e gli impianti di memoria della rappresentazione al Fox inseguono l'istituto del Cancro, il Dana-Farber Cancer Institute, il centro di ricerca dell'AIDS del diamante di Aaron e corrente al centro medico di NYU Langone.

Peter ha l'esperienza pratica dell'operazione e dell'eliminazione dell'errore della strumentazione da tutti i produttori importanti di cytometer come pure strumentazione sperimentale del prototipo.

Peter è sperimentato con la configurazione, la convalida ed i best practice del laboratorio per l'ordinamento del materiale contagioso. È coinvolgere nella teoria cytometric e nell'applicazione della copertura per lo sviluppo di programmi educativa.

Peter è stato il Presidente degli ordini professionali regionali tali a MetroFlow (New York/gruppo di utenti Cytometry del New Jersey), ai Direttori regionali di nordest di memoria di scienze biologiche (NERLSCD) e corrente sta servendo i termini da consigliere tecnico di ISAC come pure sta essendo un membro del consiglio di amministrazione del dirigente di ABRF. Peter servisce sui numerosi comitati consultivi accademici ed industriali.

Gli interessi correnti di Peter comprendono la ridefinizione del ruolo della memoria di citometria a flusso in un modello distribuito di posizione, aggiungente le nuove tecnologie quale classificazione mediante veicolo fluido centrifuga nel catalogo di servizio di memoria di citometria a flusso come pure nei metodi per verificare la riproducibilità di dati e rinforzante la posizione dei laboratori di memoria come il centro per aderenza di best practice nel centro accademico.

Scienze biologiche del coltro di Beckman - Automatico-Cellulari e ProteomicsCirca il coltro di Beckman

Per le posizioni ed i numeri di telefono mondiali dell'ufficio del coltro di Beckman, visualizzi prego “ci contattano„ a www.beckmancoulter.com.

Nel della metà del 1950 la s introdotta, il principio del coltro si è trasformata nelle fondamenta di un'industria che risponde all'esigenza degli strumenti automatizzati del contaggio di cellule. L'industria sviluppata in tre atti, come Wallace H. Coulter ed suo fratello Joseph R. Coulter, Jr., ha sviluppato l'idea semplice di passare le celle attraverso un'apertura diaframma di percezione.

Nella Legge I, il desiderio di Wallace di automatizzare il conteggio sistematico dell'eritrocito piombo ad un'idea semplice, alla definizione del principio del coltro, al suo brevetto, alla sua accettazione dagli istituti della sanità nazionali ed alla sua descrizione ad una conferenza nazionale.

Nella Legge II, i fratelli del coltro hanno indirizzato le praticità di uno strumento commerciale e di un'organizzazione di affari per supportare la sue lavorazione e vendita.

Nella Legge III, un vasto sforzo di ricerca sviluppato per quanto riguarda gli errori volumetrici che provengono dalle caratteristiche funzionali dell'apertura diaframma di percezione e l'organizzazione crescente dei fratelli' hanno trovato le soluzioni permettendo l'introduzione degli analizzatori sempre più automatizzati dell'ematologia. Oggi l'industria prospera, con parecchi partecipanti.

Il coltro di Beckman offre un intervallo degli strumenti di caratterizzazione della particella compreso:

  • Analizzatori di dimensione delle particelle di diffrazione del laser
  • COLTRO COUNTER® di Multisizer™
  • Analizzatore di dimensione delle particelle di submicron e di potenziale Zeta
  • Area ed analizzatore di dimensione del poro

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