Usando el cytometry de la elutriación centrífuga y de flujo para contestar a preguntas biológicas: una entrevista con Peter López

Prof. Peter LopezTHOUGHT LEADERS SERIES...insight from the world’s leading experts

¿Cuáles son las preguntas biológicas principales que usted ha podido contestar con el uso del cytometry de flujo?

El Cytometry de flujo, la medición de diversas características celulares como atraviesan un aparato para medir, tiene tan muchos usos que es duro saber dónde comenzar.

He estado implicado con el uso de las técnicas cytometric del flujo a la pre-investigación del cáncer de cuello del útero, la purificación de los cromosomas individuales del ratón, la identificación de las células que experimentaban apoptosis, la purificación de la célula madre, el estudio de la función del receptor del linfocito T y de la biología del linfocito T, HIV/AIDS, y los diversos usos relacionados con la biología del cáncer.

¿Cómo el uso del cytometry de flujo ha cambiado desde que usted comenzó a trabajar en el campo en 1977?

Los cytometers del flujo en los años 70 eran relativamente raros, y requirieron a un especialista dedicado operar, mantener, e interpretar los datos cerco.

El número de mediciones que se podrían hacer de cada célula fueron limitadas menos que un puñado. Los instrumentos también analizaban las células en lo que ahora consideramos ser los regímenes lentos de la producción (células <5,000 por segundo).

Los cytometers del flujo fueron fijados típicamente en las instalaciones del recurso compartido (núcleos), de modo que muchos laboratorios pudieran beneficiarse de la instrumentación y de la experiencia. Estos instrumentos eran también muy grandes y costosos, así que el uso del cytometry de flujo fue limitado a algunos centros académicos.

Vemos hoy los cytometers del flujo que han perfeccionado sumamente la producción (análisis de 70.000 células/en segundo lugar), con la capacidad de cerco más de 20 parámetros.

El matrimonio del cytometry y de la espectrometría de masa de flujo es una novedad emocionante permitiendo que aún más parámetros sean analizados que cytometry de flujo tradicional.

El repuesto de la técnica de etiqueta fluorescente ubicua usada en cytometry de flujo con los isotipos del metal para etiqueta promesas de las células la capacidad de descubrir los subconjuntos de la célula resueltos con 30 o más parámetros, aunque esta tecnología de CyToF impida la clasificación de la célula.

Cuchilla de Beckman

Haber de imagen: Cuchilla de Beckman

Otro revelado es la introducción de cytometers menos complejos y fáciles de utilizar, con el uso ahora considerado fuera de la fijación académica de la base.

Los cytometers del flujo ahora se ven rutinario en la industria farmacéutica, en agricultura y botánica, en la fabricación, en la supervisión de la calidad de la comida y del agua, en la determinación de sexo animal, en vigilar el ambiente marino, en microbiología, con un uso importante grande en diagnósticos humanos.

¿Cómo la cuchilla de Beckman ha soportado su trabajo?

La instrumentación cytometric del flujo de la cuchilla de Beckman ha estado en mi laboratorio desde los a mediados de los años ochenta. Ha sido más recientemente A.C. muy de apoyo de nuestros estudios la demostración de las ventajas de la integración de la elutriación centrífuga en el laboratorio del cytometry de flujo.

El compaginador de la célula de MoFlo CDP en NYULMC fluye instalación del Cytometry. Compaginador de alta velocidad de la célula para la recogida en montón o la reproducción unicelular de las poblaciones purificadas de la célula.

El compaginador de la célula de MoFlo CDP en NYULMC fluye instalación del Cytometry. Compaginador de alta velocidad de la célula para la recogida en montón o la reproducción unicelular de las poblaciones purificadas de la célula. Haber de imagen: Cuchilla de Beckman

¿Cuál es elutriación centrífuga y cuáles son las ventajas comparadas a otras técnicas de la purificación de la célula?

La elutriación centrífuga es una tecnología inventada por Charles Lindberg (el piloto famoso) en los años 30, y permite la separación de células según su velocidad de la sedimentación en una moda contínua usando un rotor especializado de la centrifugadora.

Este rotor permite cargar de células en la cámara de giro del elutriador, y después permiso la introducción de un almacenador intermedio que opone la dirección de la fuerza centrífuga, de tal modo fraccionando las células.

Esto tiene la ventaja importante de producir las poblaciones purificadas de células sin la necesidad químicamente de tratar o de etiqueta las células, y puede producir un gran número de células purificadas más rápidas que cytometry de flujo. La elutriación centrífuga es también un procedimiento apacible.

¿Se pueden los sistemas del elutriador mantener estéril? ¿Por qué es ésta importante para contestar ciertas preguntas biológicas?

Sí, el sistema entero de la elutriación se puede esterilizar in situ. Las muestras de la célula se pueden preparar, introducir y cerco del elutriador en una cabina estéril de la seguridad biológica, manteniendo esterilidad de la célula. Esto es importante puesto que la purificación de células es a menudo el primer paso en una serie de los análisis biológicos que implican el cultivo celular.

Un uso establecido de la elutriación es sincronizar las células en la misma fase del ciclo celular, y estas células entonces se ponen en cultivo celular u otros sistemas donde los efectos de la droga pueden ser probados, y la esterilidad es crucial en estos sistemas.

Donde las muestras se están preprocesando para la eliminación de los pequeños escombros antes de la clasificación, todos los procedimientos deben mantener esterilidad de la célula, incluyendo la elutriación y la clasificación de la célula.

¿Qué instrumentos de la cuchilla de Beckman usted utiliza en su laboratorio y porqué?

Todos los sistemas de la cuchilla de Beckman funcionando en mi laboratorio son los sistemas sólidos del caballo de labranza que contamos conectado para el rendimiento constante diario.

Por supuesto utilizamos centrifugadoras de la cuchilla de Beckman, la unidad del benchtop de Allegra X-12R y la unidad de suelo-vigente de Avanti J-20 que impulsa nuestro sistema de la elutriación de la contracorriente JE-5.0. Todas estas centrifugadoras son instrumentos bien hechos, estables.

Para la viabilidad de la célula y la determinación de la talla de célula, tenemos una cuchilla ViCell de Beckman. La talla de la viabilidad y de célula es determinaciones cruciales antes de elutriación y también útil en cytometry de flujo.

Para la célula clasificación uno de nuestros sistemas del caballo de labranza en el compaginador de alta velocidad de la célula de MoFlo XDP de la cuchilla de Beckman. Estamos en curso de colocación del cytometer del flujo del color de CytoFLEX 13 de la cuchilla de Beckman en el flujo de trabajo de nuestro laboratorio.

¿Cómo la clasificación de la célula del cytometry de flujo compara a la separación magnética de la moldura y a la elutriación centrífuga?

Cada técnica tiene sus puntos fuertes y débiles. La purificación de la célula por cytometry de flujo es incomparable en su capacidad de purificar muchas poblaciones simultáneamente (hasta 6 poblaciones usando la cuchilla MoFlo Astrios de Beckman), con la capacidad de caracterizar a estas subpoblaciones para la purificación usando 20 parámetros o más.

Puesto que cada célula individual necesita ser caracterizada para el análisis y clasificación, el cytometry de flujo tiene actualmente un “límite de velocidad”, para un resultado el número de células que se puedan purificar no estén en el mismo nivel que la elutriación o la desesperación magnética de la moldura. El nivel de la pureza elevada de células clasificación usando cytometry de flujo-- pureza del hasta 99%-- es también incomparable por otras técnicas.

La separación magnética de la moldura es una técnica fácil de usar, y en muchos casos se utiliza antes de la célula cytometric del flujo clasificación para preenriquecer las muestras para un tipo deseado de la célula. Cuando está utilizado para preprocesar muestras antes de la célula clasificación, hay un ahorrador de tiempo, especialmente al tramitar un gran número de células.

Las fuerzas de ambas tecnologías pueden ser combinadas. Puede también ser utilizada como técnica independiente de la purificación, pero puede separar solamente las células basadas en una característica -- no es un sistema multiparametric.

La elutriación centrífuga comparte algunas de las mismas ventajas y debilidades de la separación magnética de la moldura, pero desde la velocidad de la sedimentación, que es dominada por talla de célula, es el factor discriminatorio en la purificación, él puede ofrecer el enriquecimiento de células en los diversos escenarios del ciclo celular, que no se logra fácilmente usando la separación magnética. Este tipo de uso se puede realizar usando la célula cytometric del flujo clasificación, aunque en una producción más lenta.

Una ventaja muy importante de la elutriación centrífuga cuando está comparada a los métodos cytometric o magnéticos del flujo de la purificación es que las células para la elutriación centrífuga no requieren ningún tratamiento químico o el paso de etiqueta. Esto es una ventaja enorme para sincronizar las poblaciones de la célula donde no está deseable el hambre del suero o el cegar del célula-ciclo de la substancia química.

¿Qué limitaciones todavía necesitan ser vencidas?

La elutriación centrífuga es una técnica donde la experiencia desempeña un papel importante, que hace similar al cytometry de flujo a este respecto. Como se ve en las tendencias actuales para los fabricantes del cytometer del flujo, producir los sistemas que se pueden utilizar por los individuos menos experimentados sería beneficioso.

Otra limitación es la capacidad de tramitar pequeños números de la célula menos que millón de células. La especialización de sistemas más pequeños de la elutriación ayudaría a resolver esta limitación.

¿Qué usted piensa los asimientos futuros para el uso del cytometry de la elutriación centrífuga y de flujo en el contexto de contestar preguntas biológicas?

Mucho del trabajo publicado con la elutriación centrífuga muestra que tiene utilización en el syncronization de células así como la purificación de ciertas poblaciones de la célula de una población que comienza heterogénea.

Hemos demostrado la capacidad de la elutriación de reducir la cantidad de pequeños escombros presente en muchas preparaciones de la célula destinadas para la clasificación de la célula. Esto agregará una nueva aplicación al repertorio de la elutriación, para ser utilizado como paso del proceso previo antes de clasificación de la célula.

Las preparaciones hechas del material primario como los tumores disociados, usados en el estudio de los linfocitos de la infiltración del tumor pueden contener una gran cantidad de pequeños escombros que puedan hacerlo duro determinar las células del interés y alargar clase necesaria de la célula del tiempo. Acoplando una limpieza del proceso previo de las muestras escombro-cargadas san perfeccione la eficiencia rio abajo del compaginador de la célula.

El retiro de los pequeños escombros o del otro material indeseado tiene el potencial de proveer de los instrumentos de CyTOF una muestra más limpia y de perfeccionar eficiencia en ese flujo de trabajo también. Investigaremos esto en los estudios colaborativos futuros.

Usos potenciales del Cytometry de flujo

Haber de imagen: Cuchilla de Beckman

¿Dónde pueden los programas de lectura encontrar más información?

La mejor única fuente de relacionado con la información al cytometry de flujo es “Cytometry de flujo práctico”, por el Dr. Howard Shapiro, ahora en su 4ta edición. La cuchilla de Beckman ofrece un eslabón a esta referencia para la visión en línea en su Web site. http://www.coulterflow.com/bciflow/practical/book/index.html

Sobre Peter López

Peter López ha estado implicado en el campo del cytometry de flujo desde 1977 y tiene experiencia en la administración del laboratorio del recurso compartido, la operación del cytometer, el revelado del instrumento, el diseño experimental, y una amplia variedad de usos cytometric.

Peter ha manejado alto-acertado y el flujo respetado cytometric y las instalaciones de la base de la proyección de imagen en el Fox abren una ranura en al instituto del cáncer, Dana-Farber Cancer Institute, el centro de investigación del SIDA del diamante de Aaron, y actualmente en el centro médico de NYU Langone.

Peter tiene experiencia práctica con la operación y la localización de averías de la instrumentación de todos los fabricantes importantes del cytometer, e instrumentación experimental del prototipo.

Experimentan a Peter con la configuración, la validación y las mejores prácticas del laboratorio para clasificación el material infeccioso. Él está implicado en el revelado de programa educativo que reviste teoría y el uso cytometric.

Peter ha sido el presidente de sociedades profesionales regionales tales en MetroFlow (grupo de utilizador del Cytometry de Nueva York/de New Jersey), los directores regionales de nordeste de la base de las ciencias de la vida (NERLSCD), y actualmente está sirviendo términos como concejal de ISAC así como está siendo una pieza del consejo de dirección de ABRF. Peter desempeña servicios en los comités consultivos académicos e industriales numerosos.

Los intereses actuales de Peter incluyen la redefinición del papel de la base de cytometry de flujo en un modelo distribuido de la situación, agregando nuevas tecnologías tales como elutriación centrífuga en el catálogo del servicio de la base de cytometry de flujo, así como métodos para verificar reproductibilidad de los datos y fortaleciendo la posición de los laboratorios de la base como el centro para la adhesión de la mejor práctica en el centro académico.

Ciencias de la vida de la cuchilla de Beckman - Auto-Celulares y ProteomicsSobre la cuchilla de Beckman

Para las situaciones de la oficina de la cuchilla de Beckman y los números de teléfono mundiales, visite por favor “nos contacto” en www.beckmancoulter.com.

En mediados de 1950 s introducido, el principio de la cuchilla se convirtió en el asiento de una industria que respondía a la necesidad de instrumentos automatizados de la numeración celular. La industria desarrollada en tres actos, como Wallace H. Coulter y su hermano José R. Coulter, Jr., desarrolló la idea simple de pasar las células a través de una apertura que detectaba.

En el acto I, el deseo de Wallace de automatizar la cuenta rutinaria del eritrocito llevó a una idea simple, a la definición del principio de la cuchilla, a su patentar, a su aceptación de los institutos de la salud nacionales, y a su descripción en una conferencia nacional.

En el acto II, los hermanos de la cuchilla dirigieron los sentidos prácticos de un instrumento comercial y de una organización de la empresa para soportar su manufactura y venta.

En el acto III, un esfuerzo de investigación amplio desarrollado con respecto a los desvíos volumétricos que originaban en características funcionales de la apertura que detectaba, y la organización cada vez mayor de los hermanos' encontraron soluciones permiso la introducción de analizadores cada vez más automatizados de la hematología. La industria prospera hoy, con varios participantes.

La cuchilla de Beckman ofrece un alcance de las herramientas de la caracterización de la partícula incluyendo:

  • Analizadores de la talla de partícula de la difracción del laser
  • CUCHILLA COUNTER® de Multisizer™
  • Analizador de la talla de partícula del potencial y de submicron de la zeta
  • Superficie y analizador de la talla del poro

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