Complessi dinamici Rivelanti della proteina con RMN: un'intervista con Elisar Barbar

Prof. Elisar BarbarTHOUGHT LEADERS SERIES...insight from the world’s leading experts

Potete fare Prego una generalità dei vostri interessi della ricerca?

Nel mio laboratorio, mettiamo a fuoco sulla struttura, sul montaggio e sul regolamento di comprensione della rete di interazione della proteina LC8, la schiera delle interazioni LC8 con i diversi partner che pregiudicano le funzioni cellulari multiple nei sistemi biomedici.

La Maggior Parte delle proteine sono comprese nelle interazioni con un o alcun legante funzionale, ma alcune proteine, come la Catena leggera 8 (LC8), hanno numerosi partner obbligatori. LC8 interagisce con più di 100 proteine dal punto di vista funzionale differenti, dalle proteine virali per andare in automobile le proteine alle proteine in questione nella divisione cellulare.

Interazioni di LC8-IDP | Proteina RMN in una Nuova Era di Ricerca Biomedica da AZoNetwork su Vimeo.

Mentre le proteine di LC8-binding hanno molte funzioni differenti, abbiamo proposto che tutte dividessero una caratteristica comune, vale a dire, tutti sono membri di classe relativamente nuova di proteine, spesso chiamata proteine intrinsecamente disordinate o IDPs, che mancano - in tutto o in parte - di una struttura terziaria stabile. Il IDPs non non profilatura in uno stato indigeno strettamente imballato che presente un o alcun sito attivo specificamente sistemato per legare di una proteina o dell'altro substrato. Invece, le conformazioni di conversione multiple del campione di IDPs che hanno vari livelli di disordine e un sottoinsieme di questi possono legare specificamente a parecchie altre proteine profilatura.

La qualità intrinseca, o l'inerenti, attributi del IDPs è che sono disordinate prima che leghino una proteina del partner, essi conservano un certo grado di disordine dopo che legano ed il disordine è un aspetto importante della loro funzione. Che Cosa è speciale circa LC8, una proteina che è essenziale alla vita della cella, è che lega le proteine disordinate e media la loro dimerizzazione. Essere un dimero stesso, LC8 lega due catene di una proteina disordinata e le riunisce per formare un'impalcatura duplex su cui altre proteine montano con più alta affinità che quando legano un IDP monomerico.

Quanto importante è RMN nel vostro lavoro e che vantaggi fornisce sopra altre tecniche analitiche?

Per caratterizzare le funzionalità importanti di un duplex di LC8-IDP, abbiamo bisogno di una descrizione livellata atomica della sua struttura. Le tecniche disponibili per la caratterizzazione della struttura di alta risoluzione quali Cristallografia a raggi x o microscopia dell'cryo-elettrone richiedono una proteina stabile con una conformazione unica. Non sono adatte alla caratterizzazione dei complessi che comprendono le proteine intrinsecamente disordinate. Per i nostri studi, RMN è superiori alle altre tecniche perché le regioni RMN dei videi di disordine nei grandi complessi multimolecolari.

lc8-rotate-faster [5]Possiamo identificare e caratterizzare le varie conformazioni campionati in proteine disordinate ed identificare i cambiamenti conformazionali che accompagnano più d'importanza l'associazione, sia al sito dell'associazione che, ai siti distanti dall'associazione. Nelle impalcature del duplex di LC8-IDP, alcune regioni disordinate formano la struttura di ordine superiore e possiamo identificare quelle regioni per RMN.

Potete fornire Prego un esempio della vostra ricerca su un partner LC8?

Un partner LC8 è catena del composto intermedio del dynein (IC), una proteina dal motore del dynein, un grande complesso di cui il ruolo nella cella è di muovere il carico molecolare da un posto verso un altro. C'è stato la ricerca affascinante effettuata su come questo complesso si muove lungo i microtubuli. Ma siamo interessati in una regione differente di dynein, quella che chiude su carico - chiediamo che cosa determina dove il carico lega al complesso, che cosa regolamenta quando questo carico si muove e definitivo come/perché il complesso rilascia il carico quando raggiunge la sua destinazione?

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Un aspetto interessante di questo trattamento è che ci sono proteine supplementari che legano il dynein e dirigono, o regolamentano, associazione del carico e, come LC8, legatura di queste proteine ad una regione disordinata di IC, rendentegi un hub dell'attività regolatrice del carico. Ciò è dove RMN viene in- questa regione disordinata può essere studiata soltanto facendo uso di RMN. Quando una proteina regolatrice lega il complesso, usiamo RMN non solo per identificare le regioni specifiche di proteina disordinata che interagiscono con la proteina regolatrice, ma anche per riflettere i cambiamenti conformazionali nelle regioni che conservano il disordine nel complesso.

Quindi, la regione disordinata è importante perché questa è dove i regolatori legano il dynein e gli dicono che carico da portare e quando muoverlo.  Fra i regolatori che legano questo dominio sono le proteine connesse con la malattia di Huntington o il ritardo mentale, sistemi con le implicazioni biomediche importanti.

Che Cosa la vostra ricerca ha indicato?

Abbiamo indicato che un dominio chiave di dynein IC che è centrale alla funzione del dynein è intrinsecamente disordinato. Questo grande dominio di circa 300 amminoacidi è il sito del composto intermedio del dynein a catena/assembly catena leggera e la regione a cui molte proteine di regolamentazione del carico lega.

A vetrine dove legare ad un sito nella catena disordinata lunga altera l'associazione di una proteina del regolatore ad un sito distante sulla stessa catena disordinata. Un cambiamento nella sequenza aminoacidica in una regione disordinata può determinare se una proteina lega o non lega ad una regione disordinata completamente differente.  Quindi, una mutazione genetica che pregiudica la sequenza della proteina in una regione disordinata può pregiudicare l'associazione ad un sito distante e fa una differenza qualitativa nella funzione cellulare.

Ciò può essere la base molecolare di alcune malattie.  Eseguiamo gli esperimenti RMN che ci dicono quali residui specifici dell'amminoacido, o le mutazioni, sono associati con una funzione essenziale delle cellule. Se una malattia è rintracciata di nuovo alla perdita di quella funzione delle cellule, questa conoscenza strutturale molecolare può piombo ad un trattamento della malattia.

Un'Altra funzionalità interessante di disordine nella catena del composto intermedio del dynein è il suo effetto sulle differenze tessuto-specifiche tali che gli stessi impianti della proteina diversamente nel cervello che in muscoli.  La sola differenza fra il cervello contro il muscolo IC è la lunghezza dei linker disordinati. Per determinare perché un piccolo aumento nella lunghezza di un linker disordinato determina che cosa accade nel cervello relativo che cosa accade nei tessuti dei muscoli, richiediamo le tecniche livellate atomiche.

I Nostri dati implicano quello che cambia la lunghezza di una regione disordinata possono avere un grande effetto sulla popolazione delle strutture transitorie che determinano come questa proteina si comporta, sebbene la sequenza del resto della proteina disordinata non sia stata alterata. Anche se ci sono belle strutture recenti di microscopia elettronica di cryo e dei Raggi X di questo complesso, non rispondono a questo problema perché la struttura disordinata non è evidente in queste immagini.

I linker Disordinati sono egualmente i siti degli eventi di fosforilazione che determinano la funzione delle proteine. Abbiamo indicato che la fosforilazione in un linker disordinato può pregiudicare l'associazione ad un sito disordinato distante cambiando le conformazioni di una famiglia delle strutture transitorie e interconverting.  Non vediamo le conformazioni inserita/disinserita del `' ma piuttosto una variazione dinamica in una schiera delle conformazioni relative.  Ciò è un tipo di biologia che strutturale possiamo osservare soltanto con RMN.

Come questi complessi sono stati studiati tradizionalmente e perché è RMN così utile nei vostri studi?

Questi grandi complessi sono stati studiati tradizionalmente da Cristallografia a raggi x o da microscopia dell'cryo-elettrone ma le regioni di disordine sono silenziose in cristallografia. Poiché è disordinata, vediamo tutto eccetto questa regione, un problema se questo è dove vogliamo studiare l'attività molecolare.

Ciò illustra perché RMN è utile: il disordine limita l'uso di microscopia elettronica o della cristallografia, ma può essere caratterizzato facendo uso di RMN. Potete identificare le sequenze che sono disordinate, quindi determinate esattamente che gli amminoacidi disordinati legano un'altra proteina e quando/perché un regolatore lega mentre un altro non fa.

Per esempio, in una proteina del virus con una regione disordinata che lega LC8, se LC8 non lega questa proteina, il virus perde la sua capacità di produrre malattia-causare le infezioni. RMN può identificare le sedi del legame in queste regioni e potenzialmente identificare le droghe che interferiscono con l'interazione della proteina di LC8-virus.

Finora ho parlato di come bello RMN è e di come è la tecnica che riferisce i cambiamenti nei residui specifici dell'amminoacido in proteine disordinate. Mentre questo è vero, ci sono parecchie sfide a usando RMN sulle proteine disordinate, rispetto alle proteine profilatura. Con le proteine disordinate, notate la dispersione di punta molto limitata in Spettri RMN. Egualmente avete conformazioni multiple che sono difficili da selezionare e che possono provocare lo scambio che amplia, significanti che i picchi scompaiono nello spettro. Ma picco RMN che amplia prima che la scomparsa possa anche dirci circa i beni conformazionali delle regioni disordinate mentre cominciano ad interagire con LC8 ed altre proteine.

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Quanto importante è la scienza di base a creare i trattamenti per le malattie? La vostra ricerca mette a fuoco su della malattia particolare?

Mettiamo a fuoco sulla scienza di base che identifica i trattamenti molecolari che hanno una funzione essenziale in celle. Il Nostro scopo è di capire le funzioni cellulari fondamentali dei complessi della proteina di LC8-IDP nei sistemi biomedici.   Poi possiamo applicarci che cosa capiamo in una più vasta arena che include come una malattia interrompe le funzioni fondamentali dei duplex di LC8-IDP.  Ciò a sua volta può piombo a come questa malattia potrebbe vicino trattato dalle droghe che impediscono la rottura.

Legame di Parecchie malattie nei nostri studi sul dynein disordinato IC in cui i regolatori legano il dynein e gli dicono che carico da portare e quando muoverlo.  Fra i regolatori che legano questo dominio sono le proteine connesse con la malattia o il ritardo mentale di Huntington.

Studiamo altri duplex di LC8-IDP, connessi con dynein, che egualmente sono compresi nelle interazioni con molte proteine.  Gli Esempi includono i pori nucleari, che richiedono LC8 per il loro assembly ed alcune infezioni virali quali Ebola ed il virus della rabbia.

Per esempio, in virus della rabbia c'è un'interazione che di LC8-IDP ora stiamo esaminando con una proteina del virus. L'interazione di questa proteina con LC8 fa la differenza in mezzo se mouse infettati con il virus in tensione o muore. Un piccolo ma cambiamento cruciale in quell'interazione determina se il virus è letale in mammiferi.

Che Cosa sono i vostri pensieri sul finanziamento per RMN negli STATI UNITI e l'Europa?

Durante l'anno sull'anno sabbatico in Germania ed in Francia, ero molto fortunato avere accesso all'alto campo eccellente 900+ NMRs. Sono stato sorpreso a quanto finanziamento là è per strumentazione RMN in Europa.

in Europa non hanno uno strumento in ogni laboratorio ma piuttosto hanno strumenti negli impianti centrali. Questi impianti hanno gestori che raggiungono fuori agli utenti e forniscono la guida e la competenza, permettendo la gente che non può normalmente avere accesso a RMN la capacità di utilizzare lo strumento.

Inoltre, sono molto buoni nelle attività di animazione alle comunità ed alle High Schooi, informante li di importanza di scienza di base.  Ho esaminato le proposte dei ricercatori Europei che propongono gli esperimenti di scienza di base senza dovere collegarlo alla malattia perché la scienza di base è considerata abbastanza importante.

Negli STATI UNITI, sembra che ci sia più spinta per collegare la ricerca ad una maturazione di malattia piuttosto che ad avanzare la nostra comprensione della scienza di base che servisce da fondamenta per lo sviluppo delle maturazioni. E manchiamo dei tipi di impianti che centralizzati Europa ha. Ero soddisfatto di piombo gli sforzi per attirare il finanziamento federale per i 800 Megahertz qui allo Stato dell'Oregon creando una funzione che fornirà un servizio ai ricercatori nella nostra regione.

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Molti ricercatori vogliono usare RMN una volta che hanno accesso ad uno strumento, ad una gente qualificata che lo eseguono e ad una gente come me che è entusiasta del renderlo accessibile. Quando questo accade, la potenza di RMN diventa evidente ai ricercatori in molte discipline.

Che Cosa pensate le tenute future per la ricerca della proteina facendo uso di RMN?

Penso che questi siano periodi molto emozionanti per alla la ricerca RMN e basata a RMN sulle proteine disordinate. Proviamo a spingere la busta nei generi di assembly complessi e dinamici di domande che facciamo per quanto riguarda grande, della proteina. Chiediamo a domande che alcuni anni fa era soltanto un sogno a causa della difficoltà di lavoro con i complessi disordinati della proteina.

Ora, abbiamo considerevoli avanzamenti negli più alti campi, i cryoprobes che permettono la raccolta di dati sui campioni diluiti, sequenze di impulso che permettono la raccolta di dati in cinque dimensioni (ed in modo da faccia diminuire la sovrapposizione di punta) e le tecniche di calcolo che usano soltanto i dati RMN radi.

Con gli avanzamenti RMN, abbiamo i nuovi approcci creativi al preparato sistematico dei complessi delle proteine disordinate e approcci pluridisciplinari migliorati.  Questo ci posiziona Insieme per rendere a questi sogni più di una realtà.

Riassumendo, RMN è una tecnica potente perché può riflettere nelle grandi regioni disordinate dei complessi di disordine e nelle regioni di interazione ed identifica quali amminoacidi sono compresi nelle interazioni. Che le informazioni possono essere usate per identificare i cambiamenti in struttura al sito dell'associazione ed anche ad un sito distante e se c'è l'autoassociazione. Non potete ottenere questi informazioni sulle proteine disordinate facendo uso di qualunque altra tecnica.

Circa Elisar Barbar

Sono il professor nel Dipartimento della Biochimica e la Biofisica all'Oregon State University ed al mio strumento primario è RMN. La ricerca nel mio laboratorio è messa a fuoco sui grandi complessi macromolecolari organizzati intorno ad un tipo unico di impalcatura in primo luogo descritto noi, da un duplex costituito dall'associazione della proteina profilatura LC8 con due catene dell'la proteina completamente o parzialmente disordinata.

Nella dimostrazione che un'impalcatura del duplex di LC8-containing è una componente centrale di numerosi sistemi cellulari essenziali, abbiamo applicato le tecniche RMN a delucidazione dei ruoli di disordine della proteina nella funzione delle cellule.

Sono soddisfatto di piombo i riusciti sforzi recenti all'Oregon State University per il finanziamento delle concessioni importanti di strumentazione per i 800 Megahertz multiutente RMN. Il nuovo strumento sarà il più alto campo RMN nello stato dell'Oregon, che supporterà altre università nella regione, che stimola i nuovi progetti di collaborazione e, il fondamentalmente, che permetterà che noi continuiamo sviluppare gli approcci innovatori verso rivelare come i grandi complessi dinamici della proteina funzionano.

Circa Bruker

Bruker è leader di mercato in strumenti a risonanza magnetica analitici compreso RMN, EPR e imaging a risonanza magnetica preclinico (MRI). Il portafoglio del prodotto di Bruker nel campo di a risonanza magnetica comprende MRI RMN e preclinico, il EPR e il Del tempo Dominio (TD) RMN. Inoltre.

Bruker consegna l'intervallo più completo del mondo degli strumenti della ricerca permettendo alle scienze biologiche, alla scienza dei materiali, alla chimica analitica, al controllo dei processi ed alla ricerca clinica. Bruker è egualmente il magnete principale del superconduttore ed il produttore ultra alto del magnete di campo per le soluzioni di MRI e RMN.

Citations

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    Bruker BioSpin - NMR, EPR and Imaging. (2017, August 03). Complessi dinamici Rivelanti della proteina con RMN: un'intervista con Elisar Barbar. News-Medical. Retrieved on January 19, 2020 from https://www.news-medical.net/news/20160218/Revealing-dynamic-protein-complexes-with-NMR-an-interview-with-Elisar-Barbar.aspx.

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    Bruker BioSpin - NMR, EPR and Imaging. 2017. Complessi dinamici Rivelanti della proteina con RMN: un'intervista con Elisar Barbar. News-Medical, viewed 19 January 2020, https://www.news-medical.net/news/20160218/Revealing-dynamic-protein-complexes-with-NMR-an-interview-with-Elisar-Barbar.aspx.