Complexos dinâmicos de Revelação da proteína com NMR: uma entrevista com Elisar Barbar

Prof. Elisar BarbarTHOUGHT LEADERS SERIES...insight from the world’s leading experts

Por Favor pode você dar uma vista geral de seus interesses da pesquisa?

Em meu laboratório, nós centramo-nos sobre a estrutura, o conjunto e o regulamento compreensivos da rede da interacção da proteína LC8, a disposição das interacções LC8 com sócios diversos que afectam funções celulares múltiplas em sistemas biomedicáveis.

A Maioria de proteínas são envolvidas nas interacções com uma ou alguma ligante funcional, mas algumas proteínas, como a corrente clara 8 (LC8), têm sócios obrigatórios numerosos. LC8 interage com as mais de 100 proteínas funcional diferentes, das proteínas virais para viajar de automóvel proteínas às proteínas envolvidas na divisão de pilha.

Interacções de LC8-IDP | Proteína NMR em uma Era Nova da Pesquisa Biomedicável de AZoNetwork sobre Vimeo.

Quando as proteínas de LC8-binding tiverem muitas funções diferentes, nós propor que todas compartilhassem de uma característica comum, a saber, todos são membros de uma classe relativamente nova de proteínas, chamada frequentemente as proteínas intrìnseca desorganizado ou o IDPs, que faltam - inteira ou parcialmente - uma estrutura terciária estável. O IDPs não se dobra em um estado nativo firmemente embalado que presentes um ou algum local activo especificamente arranjado para ligar de uma proteína ou da outra carcaça. Em Lugar De, as conformações deconversão múltiplas da amostra do IDPs que têm vários graus de desordem, e um subconjunto destes podem ligar especificamente a diversas outras proteínas dobradas.

O intrinsic, ou o inerentes, atributos do IDPs são que é desorganizado antes que ligue uma proteína do sócio, ele retem algum grau de desordem depois que liga, e a desordem é um aspecto importante de sua função. O Que é especial sobre LC8, uma proteína que seja essencial à vida da pilha, é que liga proteínas desorganizado e negocia seu dimerization. Ser um dímero próprio, LC8 liga duas correntes de uma proteína desorganizado e trá-las junto para formar um andaime frente e verso em que outras proteínas montam com afinidade mais alta do que quando ligam um IDP monomeric.

Como importante é NMR em seu trabalho, e que benefícios fornece sobre outras técnicas analíticas?

Para caracterizar características importantes de um duplex de LC8-IDP, nós precisamos uma descrição nivelada atômica de sua estrutura. As técnicas disponíveis para a caracterização da estrutura de alta resolução tal como o cristalografia do Raio X ou a microscopia do cryo-elétron exigem uma proteína estável com uma conformação original. Não são seridos à caracterização dos complexos que envolvem proteínas intrìnseca desorganizado. Para nossos estudos, NMR são superiores às outras técnicas porque as regiões NMR dos monitores de desordem em grandes complexos multimolecular.

lc8-rotate-faster [5]Nós podemos identificar e caracterizar várias conformações provados em proteínas desorganizado e identificar as mudanças conformational que acompanham o emperramento, no local da ligação e, mais importante, nos locais distantes da ligação. Em andaimes do duplex de LC8-IDP, algumas regiões desorganizado formam uma estrutura mais alta do pedido, e nós podemos identificar aquelas regiões por NMR.

Por Favor pode você dar um exemplo de sua pesquisa em um sócio LC8?

Um sócio LC8 é a corrente intermediária do dynein (IC), uma proteína do motor do dynein, um grande complexo cujo o papel na pilha seja mover a carga molecular de um lugar para outro. Houve uma pesquisa fascinante feita sobre como este complexo se move ao longo dos microtubules. Mas nós estamos interessados em uma região diferente de dynein, essa que trava na carga - nós perguntamos o que determina onde a carga liga ao complexo, o que regula quando esta carga se move e finalmente como/porque o complexo libera a carga quando alcança seu destino?

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Um aspecto interessante deste processo é que há as proteínas adicionais que ligam o dynein e o dirigem, ou o regulam, emperramento da carga e, como LC8, ligamento destas proteínas a uma região desorganizado do IC, fazendo lhe um cubo da actividade reguladora da carga. Isto é o lugar onde NMR entra - esta região desorganizado pode somente ser utilização estudada NMR. Quando uma proteína reguladora liga o complexo, nós usamo-nos NMR para identificar não somente as regiões específicas de uma proteína desorganizado que interagem com a proteína reguladora, mas para monitorar igualmente mudanças conformational nas regiões que retêm a desordem no complexo.

Assim, a região desorganizado é importante porque esta é o lugar onde os reguladores ligam o dynein e lhe dizem que carga a levar e quando a mover.  Entre os reguladores que ligam este domínio são as proteínas associadas com a doença de Huntington ou o atraso mental, sistemas com implicações biomedicáveis importantes.

Que sua pesquisa mostrou?

Nós mostramos que um domínio chave do dynein IC que é central à função do dynein é intrìnseca desorganizado. Este grande domínio de aproximadamente 300 ácidos aminados é o local da corrente intermediária do dynein/conjunto corrente clara, e a região a que muitas proteínas de regulamento da carga liga.

Nós mostramos a casos onde ligar em um local na corrente desorganizado longa altera o emperramento de uma proteína do regulador em um local distante na mesma corrente desorganizado. Uma mudança na seqüência de ácido aminado em uma região desorganizado pode determinar se uma proteína liga ou não liga a uma região desorganizado completamente diferente.  Assim, uma mutação genética que afecta a seqüência da proteína em uma região desorganizado pode afectar o emperramento em um local distante, e faz uma diferença qualitativa na função celular.

Esta pode ser a base molecular de algumas doenças.  Nós executamos as experiências NMR que nos dizem que resíduos específicos do ácido aminado, ou as mutações, são associados com uma função essencial da pilha. Se uma doença é seguida de volta à perda dessa função da pilha, este conhecimento estrutural molecular pode conduzir a um tratamento da doença.

Uma Outra característica interessante da desordem na corrente intermediária do dynein é seu efeito em diferenças tecido-específicas tais que os mesmos trabalhos da proteína diferentemente no cérebro do que nos músculos.  A única diferença entre o cérebro contra o músculo IC está a um comprimento de linkers desorganizado. Para determinar porque um aumento pequeno do comprimento de um linker desorganizado determina o que acontece no cérebro relativo ao que acontece em tecidos dos músculos, nós exigimos técnicas niveladas atômicas.

Nossos dados implicam aquele que muda o comprimento de uma região desorganizado podem ter um efeito grande na população das estruturas transientes que determinam como esta proteína se comporta, embora a seqüência do resto da proteína desorganizado não seja alterada. Mesmo que haja umas estruturas bonitas recentes da microscopia de elétron do Raio X e do cryo deste complexo, não respondem a esta pergunta porque a estrutura desorganizado não é evidente nestas imagens.

Os linkers Desorganizado são igualmente os locais dos eventos da fosforilação que determinam a função das proteínas. Nós mostramos que a fosforilação em um linker desorganizado pode afectar o emperramento em um local desorganizado distante mudando as conformações de uma família de estruturas transientes, interconverting.  Nós não vemos conformações de ligar/desligar do `' mas um pouco uma SHIFT dinâmica em uma disposição de conformações relacionadas.  Este é um tipo de biologia que estrutural nós podemos observar somente com NMR.

Como estes complexos foram estudados tradicional e por que é NMR tão útil em seus estudos?

Estes grandes complexos foram estudados tradicional pelo cristalografia do Raio X ou pela microscopia do cryo-elétron mas as regiões de desordem são silenciosas no cristalografia. Porque é desorganizado, nós vemos tudo exceto esta região, um problema se este é o lugar onde nós queremos estudar a actividade molecular.

Isto ilustra porque NMR é útil: a desordem limita o uso da microscopia de elétron ou do cristalografia, mas pode ser utilização caracterizada NMR. Você pode identificar as seqüências que são desorganizado, a seguir determina exactamente que os ácidos aminados desorganizado ligam uma outra proteína e quando/porque um regulador liga quando outro não fizer.

Por exemplo, em uma proteína do vírus com uma região desorganizado que ligue LC8, se LC8 não liga esta proteína, o vírus perde sua capacidade para produzir a doença-causa de infecções. NMR pode identificar locais obrigatórios nestas regiões e potencial identificar as drogas que interferem com a interacção da proteína de LC8-virus.

Eu tenho falado Até agora sobre como NMR bonito é e como é a técnica que relata mudanças em resíduos específicos do ácido aminado em proteínas desorganizado. Quando isto for verdadeiro, há bastante alguns desafios à utilização NMR nas proteínas desorganizado, comparadas com as proteínas dobradas. Com proteínas desorganizado, você observa dispersão máxima muito limitada em espectros NMR. Você igualmente tem as conformações múltiplas que são difíceis de classificar para fora e que podem conduzir à troca que alarga, significando que os picos desaparecem no espectro. Mas pico NMR que alarga antes que o desaparecimento puder igualmente nos dizer sobre as propriedades conformational de regiões desorganizado enquanto começam a interagir com o LC8 e as outras proteínas.

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Como importante é a ciência básica a criar tratamentos para doenças? Sua pesquisa centra-se sobre alguma doença particular?

Nós centramo-nos sobre a ciência básica que identifica os processos moleculars que têm uma função essencial nas pilhas. Nosso objetivo é compreender funções celulares fundamentais de complexos da proteína de LC8-IDP em sistemas biomedicáveis.   Então nós podemos aplicar-se o que nós compreendemos em uma arena mais larga que inclua como uma doença interrompe as funções fundamentais de duplex de LC8-IDP.  Isto por sua vez pode conduzir a como esta doença pôde tratado perto pelas drogas que impedem o rompimento.

Laço de Diversas doenças em nossos estudos do dynein desorganizado IC onde os reguladores ligam o dynein e lhe dizem que carga a levar e quando a mover.  Entre os reguladores que ligam este domínio são as proteínas associadas com a doença ou o atraso mental de Huntington.

Nós estudamos outros duplex de LC8-IDP, não associados com o dynein, que são envolvidos igualmente nas interacções com muitas proteínas.  Os Exemplos incluem os poros nucleares, que exigem LC8 para seu conjunto e algumas infecções virais tais como Ebola e vírus de raiva.

Por exemplo, no vírus de raiva há uma interacção que de LC8-IDP nós estamos olhando agora com uma proteína do vírus. A interacção desta proteína com LC8 faz a diferença no meio se os ratos contaminados com o vírus vivo ou morre. Um mudança pequena mas crucial nessa interacção determina se o vírus é letal nos mamíferos.

Que são seus pensamentos no financiamento para NMR nos E.U. e na Europa?

Durante um ano em sabático em Alemanha e em França, Eu era muito afortunado ter o acesso ao campo alto super 900+ NMRs. Eu fui surpreendido em quanto financiamento lá é para a instrumentação NMR em Europa.

Em Europa não têm um instrumento em cada laboratório mas têm um pouco instrumentos em facilidades centrais. Estas facilidades têm os gerentes que alcançam para fora aos usuários e fornecem a ajuda e a experiência, permitindo os povos que não podem normalmente ter o acesso a NMR a capacidade para usar o instrumento.

Também, são muito bons em actividades de outreach às comunidades e às High Schools, fazendo os cientes da importância da ciência básica.  Eu revi propostas pelos investigador Europeus que propor experiências da ciência básica sem ter que o ligar à doença porque a ciência básica é considerada importante bastante.

Nos E.U., parece que há mais impulso para ligar a pesquisa a uma cura da doença um pouco do que a promover nossa compreensão da ciência básica que serve como a fundação para a revelação das curas. E nós faltamos os tipos de facilidades que centralizadas Europa tem. Eu era satisfeito conduzir esforços para atrair aqui o financiamento federal para uns 800 Megahertz no Estado de Oregon criando uma facilidade que prestasse serviços de manutenção a pesquisadores em nossa região.

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Muitos pesquisadores querem usar NMR uma vez que têm o acesso a um instrumento, a uns povos qualificados que executam o e a um pessoa como mim que seja entusiástico sobre a factura dele acessível. Quando isto acontece, a potência de NMR torna-se aparente aos pesquisadores em muitas disciplinas.

Que você pensa as posses futuras para a utilização da pesquisa da proteína NMR?

Eu penso que estas são épocas muito emocionantes para a pesquisa NMR e NMR-baseada sobre proteínas desorganizado. Nós tentamos empurrar o envelope nos tipos dos conjuntos das perguntas que nós fazemos em relação a grande, os complexos e os dinâmicos da proteína. Nós fazemos as perguntas que eram há alguns anos atrás somente um sonho devido à dificuldade do trabalho com complexos desorganizado da proteína.

Agora, nós temos avanços consideráveis em uns campos mais altos, os cryoprobes que permitem o levantamento de dados em amostras diluídas, as seqüências do pulso que permitem o levantamento de dados em cinco dimensões (e assim que diminua a sobreposição máxima) e as técnicas computacionais que utilizam somente dados NMR escassos.

Junto com avanços NMR, nós temos aproximações criativas novas à preparação rotineira dos complexos de proteínas desorganizado, e aproximações multidisciplinares aumentadas.  Junto isto posiciona-nos para fazer a estes sonhos mais de uma realidade.

Em resumo, NMR é uma técnica poderosa porque pode monitorar em grandes regiões desorganizado dos complexos de desordem e em regiões de interacção, e identifica que ácidos aminados são envolvidos nas interacções. Que a informação pode ser usada para identificar mudanças na estrutura no local da ligação e igualmente em um local distante e se há uma auto-associação. Você não pode obter esta informação sobre proteínas desorganizado usando nenhuma outra técnica.

Sobre Elisar Barbar

Eu sou um professor no Departamento da Bioquímica e a Biofísica na Universidade Estadual de Oregon e em minha ferramenta preliminar é NMR. A pesquisa em meu laboratório é centrada sobre os grandes complexos macromoleculares organizados em torno de um tipo original de andaime descrito primeiramente por nós, por um duplex formado pela associação da proteína dobrada LC8 com as duas correntes do a proteína inteiramente ou parcialmente desorganizado.

Em demonstrar que um andaime do duplex de LC8-containing é um componente central de sistemas celulares essenciais numerosos, nós aplicamos técnicas NMR à elucidação dos papéis da desordem da proteína na função da pilha.

Eu sou satisfeito conduzir os esforços bem sucedidos recentes na Universidade Estadual de Oregon para financiar de concessões principais da instrumentação para um multi-usuário 800 Megahertz NMR. O instrumento novo será o campo o mais alto NMR no estado de Oregon, apoiará outras universidades na região, estimula projectos colaboradores novos, e, o mais crucial, permitirá que nós mantenham-se desenvolver aproximações inovativas para a revelação de como os grandes complexos dinâmicos da proteína trabalham.

Sobre Bruker

Bruker é lider do mercado em incluir analítico dos instrumentos da ressonância magnética NMR, em EPR e em ressonância magnética pré-clínica (MRI). A carteira do produto de Bruker no campo da ressonância magnética inclui MRI NMR, pré-clínico, EPR e Tempo-Domínio (TD) NMR. Além.

Bruker entrega a escala a mais detalhada do mundo de ferramentas da pesquisa permitindo a ciência da vida, a ciência de materiais, a pesquisa analítica da química, a controle de processos e a clínica. Bruker é igualmente o ímã principal do supercondutor e o fabricante ultra alto do ímã de campo para soluções NMR e de MRI.

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    Bruker BioSpin - NMR, EPR and Imaging. (2017, August 03). Complexos dinâmicos de Revelação da proteína com NMR: uma entrevista com Elisar Barbar. News-Medical. Retrieved on January 28, 2020 from https://www.news-medical.net/news/20160218/Revealing-dynamic-protein-complexes-with-NMR-an-interview-with-Elisar-Barbar.aspx.

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