Complejos dinámicos de la proteína Que Revelan con el RMN: una entrevista con Elisar Barbar

Prof. Elisar BarbarTHOUGHT LEADERS SERIES...insight from the world’s leading experts

¿Puede usted dar Por Favor una reseña de sus intereses de la investigación?

En mi laboratorio, nos centramos en la estructura, el ensamblaje y la regla de comprensión de la red de la acción recíproca de la proteína LC8, el arsenal de las acciones recíprocas LC8 con los socios diversos que afectan a funciones celulares múltiples en sistemas biomédicos.

La Mayoría de las proteínas están implicadas en acciones recíprocas con un o algún ligands funcionales, pero algunas proteínas, como el encadenamiento pálido 8 (LC8), tienen socios obligatorios numerosos. LC8 obra recíprocamente con más de 100 proteínas funcionalmente diversas, de las proteínas virales para viajar en automóvili las proteínas a las proteínas implicadas en la división celular.

Acciones Recíprocas de LC8-IDP | Proteína RMN en una Nueva Era de Investigación Biomédica de AZoNetwork sobre Vimeo.

Mientras Que las proteínas de LC8-binding tienen muchas diversas funciones, hemos propuesto que todas comparten una característica común, a saber, todas son piezas relativamente de una nueva clase de proteínas, a menudo llamada las proteínas intrínseco desordenadas o el IDPs, que faltan - entera o parcialmente - una estructura terciaria estable. El IDPs no plegable en un estado nativo apretado pila de discos que los presentes un o algún sitios activos específicamente dispuestos para atar de la proteína o del otro substrato. En Lugar, las conformaciones inter-que convierten múltiples de la muestra del IDPs que tienen diversos grados de desorden, y un subconjunto de éstos pueden atar específicamente a varias otras proteínas plegables.

Lo intrínseco, o el inherentes, los atributos del IDPs es que son desordenados antes de que aten una proteína del socio, ellos conservan un cierto grado de desorden después de que aten, y el desorden es un aspecto importante de su función. Cuál es especial sobre LC8, una proteína que es esencial para la vida de la célula, es que ata las proteínas desordenadas y media su dimerización. El Ser un dimero sí mismo, LC8 ata dos encadenamientos de una proteína desordenada y los trae juntos para formar un andamio doble sobre el cual otras proteínas ensamblen con una afinidad más alta que cuando atan un IDP monomérico.

¿Cómo importante es el RMN en su trabajo, y qué ventajas proporciona sobre otras técnicas analíticas?

Para caracterizar características importantes de un duplex de LC8-IDP, necesitamos una descripción nivelada atómica de su estructura. Las técnicas disponibles para la caracterización de la estructura de alta resolución tal como cristalografía de la Radiografía o microscopia del cryo-electrón requieren una proteína estable con una conformación única. No se adaptan a la caracterización de los complejos que implican las proteínas intrínseco desordenadas. Para nuestros estudios, el RMN es superior a las otras técnicas porque el RMN vigila regiones de desorden en complejos multimoleculares grandes.

lc8-rotate-faster [5]Podemos determinar y caracterizar diversas conformaciones muestreados en proteínas desordenadas y determinar los cambios conformacionales que acompañan el atascamiento, en el sitio de atar y, más importantemente, en los sitios distantes de atar. En andamios del duplex de LC8-IDP, algunas regiones desordenadas forman una estructura más de categoría alta, y podemos determinar esas regiones por el RMN.

¿Puede usted dar Por Favor un ejemplo de su investigación en un socio LC8?

Un socio LC8 es el encadenamiento intermedio del dynein (IC), una proteína del motor del dynein, un complejo grande cuyo papel en la célula sea mover el cargamento molecular a partir de un lugar a otro. Ha habido investigación fascinadora hecha sobre cómo este complejo se mueve a lo largo de microtubules. ¿Pero estamos interesados en una diversa región de dynein, la que cierra sobre el cargamento - preguntamos qué determina dónde el cargamento ata al complejo, qué regula cuando este cargamento se mueve y finalmente cómo/porqué el complejo release/versión el cargamento cuando alcanza su destino?

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Un aspecto interesante de este proceso es que hay las proteínas adicionales que atan el dynein y dirigen, o lo regulan, atascamiento del cargamento y, como LC8, lazo de estas proteínas a una región desordenada de IC, haciéndole un cubo de actividad reguladora del cargamento. Aquí es adonde viene el RMN hacia adentro - esta región desordenada se puede estudiar solamente usando el RMN. Cuando una proteína reguladora ata el complejo, utilizamos el RMN no sólo para determinar las regiones específicas de una proteína desordenada que obran recíprocamente con la proteína reguladora, pero también para vigilar cambios conformacionales en las regiones que conservan desorden en el complejo.

Así, la región desordenada es importante porque aquí es donde los reguladores atan el dynein y le informan qué cargamento a llevar y cuándo moverlo.  Entre los reguladores que atan este dominio son las proteínas asociadas a la enfermedad de Huntington o a la retardación mental, sistemas con implicaciones biomédicas importantes.

¿Qué su investigación ha mostrado?

Mostramos que un dominio dominante del dynein IC que es central a la función del dynein es intrínseco desordenado. Este dominio grande de cerca de 300 aminoácidos es el sitio del encadenamiento intermedio del dynein/ensamblaje del encadenamiento pálido, y la región a la cual muchas proteínas de regulación del cargamento ata.

Mostramos a casos donde el atar en un sitio en el encadenamiento desordenado largo altera el atascamiento de una proteína del regulador en un sitio distante en el mismo encadenamiento desordenado. Un cambio en la serie de aminoácido en una región desordenada puede determinar si una proteína ata o no ata a una región desordenada totalmente diversa.  Así, una mutación genética que afecta a la serie de la proteína en una región desordenada puede afectar al atascamiento en un sitio distante, y diferencia cualitativo en la función celular.

Ésta puede ser la base molecular de algunas enfermedades.  Realizamos los experimentos del RMN que nos informan qué residuos específicos del aminoácido, o las mutaciones, se asocian a una función esencial de la célula. Si una enfermedad se rastrea a la baja de esa función de la célula, este conocimiento estructural molecular puede llevar a un tratamiento de la enfermedad.

Otra característica interesante del desorden en encadenamiento intermedio del dynein es su efecto sobre diferencias tejido-específicas tales que los mismos trabajos de la proteína diferentemente en el cerebro que en músculos.  La única diferencia entre el cerebro comparado con el músculo IC es la longitud de máquinas para hacer chorizos desordenadas. Para determinar porqué un pequeño aumento en la longitud de una máquina para hacer chorizos desordenada determina lo que suceso en el cerebro en relación con qué suceso en tejidos de los músculos, requerimos técnicas niveladas atómicas.

Nuestros datos implican eso que cambia la longitud de una región desordenada pueden tener un efecto grande sobre la población de estructuras transitorias que determinen cómo esta proteína se comporta, aunque la serie del descanso de la proteína desordenada no se haya alterado. Aunque hay estructuras hermosas recientes de la microscopia electrónica de la Radiografía y del cryo de este complejo, no contestan a esta pregunta porque la estructura desordenada no es evidente en estas imágenes.

Las máquinas para hacer chorizos Desordenadas son también los sitios de las acciones de la fosforilación que determinan la función de las proteínas. Hemos mostrado que la fosforilación en una máquina para hacer chorizos desordenada puede afectar al atascamiento en un sitio desordenado distante cambiando las conformaciones de una familia de estructuras transitorias, interconverting.  No vemos conformaciones con./desc. del `' sino bastante una rotación dinámica en un arsenal de conformaciones relacionadas.  Éste es un tipo de biología estructural que podemos observar solamente con el RMN.

¿Cómo estos complejos fueron estudiados tradicionalmente y por qué es el RMN tan útil en sus estudios?

Estos complejos grandes han sido estudiados tradicionalmente por cristalografía de la Radiografía o microscopia del cryo-electrón pero las regiones de desorden son silenciosas en cristalografía. Porque es desordenada, vemos todo excepto esta región, un problema si aquí es donde queremos estudiar actividad molecular.

Esto ilustra porqué el RMN es útil: el desorden limita el uso de la microscopia electrónica o de la cristalografía, pero se puede caracterizar usando el RMN. Usted puede determinar las series que son desordenadas, después determina exactamente que los aminoácidos desordenados atan otra proteína y cuando/porqué un regulador ata mientras que no lo hace otro.

Por ejemplo, en una proteína del virus con una región desordenada que ate LC8, si LC8 no ata esta proteína, el virus pierde su capacidad de producir enfermedad-causar infecciones. El RMN puede determinar puntos de enlace en estas regiones y potencialmente determinar las drogas que interfieren con la acción recíproca de la proteína de LC8-virus.

He hablado Hasta ahora de cómo es el RMN hermoso y de cómo es la técnica que señala cambios en residuos específicos del aminoácido en proteínas desordenadas. Mientras Que esto es verdad, hay muy algunos retos a usar el RMN en las proteínas desordenadas, comparadas con las proteínas plegables. Con las proteínas desordenadas, usted nota la dispersión máxima muy limitada en Espectros de Rmn. Usted también tiene conformaciones múltiples que sean difíciles de arreglar y que puedan dar lugar al intercambio que ensancha, significando que los picos desaparecen en el espectro. Pero pico del RMN que ensancha antes de que la desaparición pueda también informarnos sobre las propiedades conformacionales de regiones desordenadas mientras que comienzan a obrar recíprocamente con LC8 y otras proteínas.

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¿Cómo importante es la ciencia básica a crear los tratamientos para las enfermedades? ¿Su investigación se centra en enfermedad determinada?

Nos centramos en la ciencia básica que determina los procesos moleculares que tienen una función esencial en células. Nuestra meta es entender funciones celulares fundamentales de los complejos de la proteína de LC8-IDP en sistemas biomédicos.   Entonces podemos aplicarnos lo que entendemos en una arena más amplia que incluya cómo una enfermedad rompe las funciones fundamentales de los duplex de LC8-IDP.  Esto a su vez puede llevar a cómo pudo esta enfermedad cerca tratado por las drogas que previenen la desorganización.

Amarre de Varias enfermedades en nuestros estudios del dynein desordenado IC donde los reguladores atan el dynein y le informan qué cargamento a llevar y cuándo moverlo.  Entre los reguladores que atan este dominio son las proteínas asociadas a la enfermedad o a la retardación mental de Huntington.

Estudiamos otros duplex de LC8-IDP, no asociados al dynein, que también están implicados en acciones recíprocas con muchas proteínas.  Los Ejemplos incluyen los poros nucleares, que requieren LC8 para su ensamblaje y algunas infecciones virales tales como Ebola y virus de rabia.

Por ejemplo, en virus de rabia hay una acción recíproca de LC8-IDP que ahora estamos observando con una proteína del virus. La acción recíproca de esta proteína con LC8 diferencia en medio si los ratones infectados con el virus vivo o muere. Un cambio pequeño pero crucial en esa acción recíproca determina si el virus es mortal en mamíferos.

¿Cuáles son sus pensamientos en el financiamiento para el RMN en los E.E.U.U. y la Europa?

Durante un año en sabático en Alemania y Francia, era muy afortunado tener acceso al alto campo estupendo 900+ RMN. Me sorprendieron en cuánto financiamiento allí está para la instrumentación del RMN en Europa.

En Europa no tienen un instrumento en cada laboratorio sino tuvieron bastante instrumentos en recursos centrales. Estos recursos tienen los gerentes que alcanzan fuera a los utilizadores y proporcionan a ayuda y a experiencia, permitiendo a la gente que puede normalmente no tener acceso al RMN la capacidad de utilizar el instrumento.

También, son muy buenos en actividades de outreach a las comunidades y a las High Schools secundarias, haciéndolas enteradas de la importancia de la ciencia básica.  He revisado ofertas por los investigadores Europeos que proponen experimentos de la ciencia básica sin tener que conectarlo a la enfermedad porque la ciencia básica se considera bastante importante.

En los E.E.U.U., parece que hay más empuje para conectar la investigación a una vulcanización de la enfermedad bastante que a fomentar nuestra comprensión de la ciencia básica que sirve como el asiento para el revelado de vulcanizaciones. Y faltamos los tipos de recursos centralizados que Europa tiene. Fui satisfecho llevar esfuerzos de atraer el financiamiento federal para los 800 Megaciclos aquí en el Estado de Oregon creando un recurso que abastecerá a investigadores en nuestra región.

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Muchos investigadores quieren utilizar el RMN una vez que tienen acceso a un instrumento, a una gente calificada que lo ejecuta y a una gente como yo que sea entusiasta sobre la fabricación de él accesible. Cuando suceso esto, la potencia del RMN llega a ser evidente a los investigadores en muchas disciplinas.

¿Qué usted piensa los asimientos futuros para la investigación de la proteína usando el RMN?

Pienso que éstas son épocas muy emocionantes para el RMN e investigación RMN-basada sobre las proteínas desordenadas. Intentamos activar el envolvente en las clases de ensamblajes de preguntas que hacemos con respecto a grande, complejos y dinámicos de la proteína. Hacemos las preguntas que hace unos años eran solamente un sueño debido a la dificultad del trabajo con los complejos desordenados de la proteína.

Ahora, tenemos considerables adelantos en campos más altos, los cryoprobes que permiten la colección de datos en muestras diluídas, las series del pulso que permiten la colección de datos en cinco dimensiones (y así que disminuya el traslapo máximo) y las técnicas de cómputo que hacen uso solamente de datos escasos del RMN.

Junto con adelantos del RMN, tenemos nuevas aproximaciones creativas a la preparación rutinaria de los complejos de proteínas desordenadas, y aproximaciones multidisciplinarias aumentadas.  Juntos esto nos coloca para hacer estos sueños más de una realidad.

En resumen, el RMN es una técnica potente porque puede vigilar en regiones desordenadas grandes de los complejos de desorden y regiones de acción recíproca, y determina qué aminoácidos están implicados en acciones recíprocas. Que la información se puede utilizar para determinar cambios en estructura en el sitio de atar y también en un sitio distante y si hay autoasociación. Usted no puede conseguir esta información sobre las proteínas desordenadas usando ninguna otra técnica.

Sobre Elisar Barbar

Soy profesor en el Departamento de la Bioquímica y la Biofísica en la Universidad de Estado de Oregon y mi herramienta primaria es RMN. La investigación en mi laboratorio se centra en los complejos macromoleculares grandes ordenados alrededor de un tipo único de andamio primero descrito por nosotros, un duplex formado por la asociación de la proteína plegable LC8 con dos encadenamientos de la proteína completo o parcialmente desordenada.

En la demostración de que un andamio del duplex de LC8-containing es un componente central de sistemas celulares esenciales numerosos, aplicamos técnicas del RMN a la aclaración del papeles del desorden de la proteína en la función de la célula.

Estoy satisfecho llevar los esfuerzos acertados recientes en la Universidad de Estado de Oregon para financiar de las concesiones importantes de la instrumentación para los 800 Megaciclos multiusos RMN. El nuevo instrumento será el campo más alto RMN del estado de Oregon, utilizará otras universidades en la región, estimula nuevos proyectos colaborativos, y, lo más crucial posible, permitirá que guardemos el desarrollar de aproximaciones innovadoras hacia revelar cómo los complejos grandes dinámicos de la proteína trabajan.

Sobre Bruker

Bruker es líder del mercado en instrumentos de resonancia magnética analíticos incluyendo el RMN, el EPR y la proyección de imagen de resonancia magnética preclínica (MRI). La cartera del producto de Bruker en el campo de resonancia magnética incluye RMN, MRI preclínico, EPR y el Tiempo-Dominio (TD) RMN. Además.

Bruker entrega el rango más completo del mundo de las herramientas de la investigación activando las ciencias de la vida, la ciencia material, la química analítica, el mando de proceso y la investigación clínica. Bruker es también el imán de cabeza del superconductor y el fabricante ultra alto del electroimán del campo para las soluciones del RMN y de MRI.

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    Bruker BioSpin - NMR, EPR and Imaging. (2017, August 03). Complejos dinámicos de la proteína Que Revelan con el RMN: una entrevista con Elisar Barbar. News-Medical. Retrieved on January 26, 2020 from https://www.news-medical.net/news/20160218/Revealing-dynamic-protein-complexes-with-NMR-an-interview-with-Elisar-Barbar.aspx.

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