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La méthode neuve de CRISPR-EZ effectue le génome éditant beaucoup plus facile chez les souris

L'Université de Californie, scientifiques de Berkeley ont développé un plus rapide et plus de technique performante pour modifier les gènes des souris avec CRISPR-Cas9, simplifiant une procédure s'élevant dans la popularité à cause de la facilité d'utiliser l'outil neuf de gène-retouche.

Tandis que CRISPR-Cas9 a attiré l'attention mondiale à cause de son potentiel de rectifier les maladies héréditaires simples chez l'homme, des chercheurs fondamentaux sont excités au sujet de sa capacité de les aider pour comprendre les causes et pour développer des demandes de règlement pour les maladies plus complexes, y compris le cancer et la démence.

Pour faire que, ils doivent assommer ou modifier les gènes spécifiques chez des animaux de laboratoire - en particulier, des souris - et voir ce qui va de travers. L'étalon-or d'aujourd'hui pour produire ces « coups de grâce » ou « knockins » est d'éditer les gènes à l'intérieur des cellules souche embryonnaires de souris, emploie ces cellules pour produire des souris de mosaïque, et puis métisse les souris pour obtenir une tension génétique pure. À cause de la capacité de CRISPR-Cas9 avec précision de modifier ou remonter des gènes, la retouche de plus en plus est faite directement dans l'oeuf fécondé, ou l'embryon tôt.

La méthode neuve, CRISPR-EZ appelé (électroperméabilisation de CRISPR RNP des zygotes), facilite la retouche de génome dans des embryons de souris encore.

« Les analyses principales principales au sujet de la signification biologique d'un gène viennent habituellement in vivo des études de gène-retouche, dans lesquelles vous produisez des souris avec un gène modifié, » ont dit le chercheur Lin de fil lui, un professeur agrégé d'Uc Berkeley de moléculaire et biologie cellulaire. « Mais c'est un engagement important pour effectuer un coup de grâce nouveau avec le bureau d'études de génome. Je pense que cette technologie pourrait grand réduire l'entrave technique pour ce type d'effort et permettra à des gens de concentrer plus sur la science plutôt que soyez absorbé par le procédé de concevoir génétiquement des souris. »

La méthode neuve, décrite dans l'édition de cette semaine du tourillon de la biochimie, vient à bout un goulot d'étranglement long en produisant les souris knockout : utilisant les pointeaux microscopiques pour injecter des molécules de gène-retouche dans un oeuf fécondé.

Les chercheurs d'Uc Berkeley ont constaté qu'une électroperméabilisation appelée simple de technique de laboratoire fonctionne bien mieux, leur permettant d'insérer des molécules de la gène-retouche CRISPR-Cas9 dans des embryons avec presque 100 pour cent de réussite. L'électroperméabilisation emploie une secousse de l'électricité pour produire des trous dans les embryons par lesquels les molécules peuvent entrer.

Utilisant CRISPR-EZ dans une expérience pilote, il est équipe avec succès abrupte les deux copies d'un gène cible dans 88 pour cent des souris. La procédure a produit d'un nombre beaucoup plus grand de souris éditées comparées au microinjection de CRISPR, en grande partie dû à une importante amélioration dans la viabilité d'embryon. CRISPR-EZ est une méthodologie simple et rentable, et peut être exécuté sur beaucoup d'embryons immédiatement et des miliseconds de prises seulement, il a dit.

« Dans le passé non trop éloigné, elle coûterait au moins $25.000 et prendrait au moins 6 mois pour effectuer une souris knockout, » a dit Russell Vance, un professeur d'Uc Berkeley de moléculaire et biologie cellulaire et directeur du laboratoire de cancérologie, où le travail transgénique de souris a été effectué. « Avec CRISPR, et améliorations telles que CRISPR-EZ, les coûts et le temps les deux ont relâché au moins 10 fois. Ces innovations techniques effectuent à la souris bien plus de puissant outil pour modéliser les maladies humaines. »

Le groupe d'Uc Berkeley fonctionne maintenant avec plusieurs installations transgéniques de souris dans les espoirs qu'ils adopteront et améliorer cette technique d'électroperméabilisation, qu'il soupçonne simplifiera également la création d'autres mammifères transgéniques.

Les coups de grâce exigent l'équipe d'IVF

Produire les souris transgéniques exige une équipe qualifiée de fécondation in vitro. Les injections d'hormone d'utilisation de techniciens pour préparer les femelles pour se conjuguer, après quoi elles moissonnent les oeufs fécondés et, avant que les oeufs commencent à se diviser, pour les injecter un par un utilisant une aiguille fine. Actuel, les techniciens injectent deux molécules d'ARN - l'ARN messager (ARNm), qui code pour la protéine Cas9, et l'ARN de guide, qui fournit l'adresse pour l'objectif de CRISPR-Cas9 - et espèrent que l'ARNm est correctement traduit en protéine Cas9 et que la protéine combine correctement avec de l'ARN de guide.

Les embryons conçus sont implantés dans une souris de manière trompeuse enceinte, où ils sont en gestation pendant environ 20 jours avant la naissance. Vu les morts inévitables d'embryon pendant l'injection et la défaillance des embryons d'implanter ou aller nommer, le régime de sous tension-naissance est inférieure, il a dit.

« Le pourcentage réel des nouveau-nés des embryons injectés est environ 10 à 15 pour cent pour la plupart des installations transgéniques, qui est un problème avec la procédure, » il a dit. « Parfois les gens rassemblent plus de 100 embryons juste pour produire d'un ou deux souris avec la retouche désirable de gène. »

L'électroperméabilisation semble faire moins de dégâts aux embryons que le microinjection : entre 30 et 50 pour cent des embryons a eu comme conséquence des nouveau-nés.

Apparemment, aussi, l'insertion des molécules CRISPR-Cas9 prémontées dans l'oeuf fécondé est plus de façon efficace d'éditer des gènes qu'injectant deux molécules - l'ARN d'ARNm et de guide - et espérant qu'elles auto-montent correctement. Des nouveau-nés, 88 pour cent des souris ont eu les deux copies du gène cible édité - un taux de succès plus élevé qu'habituel pour des procédures transgéniques, il a dit.

Pour une procédure plus complexe - modifiant une courte séquence d'ADN dans un gène - la méthode était des 42 pour cent couronné de succès du temps dans une expérience pilote.

« Avec un taux de succès si élevé, vous pouvez employer ceci pour vérifier votre guide RNAs très rapidement, » il a dit. « Si votre CRISPR-EZ ne fonctionne pas, il n'est pas à cause de la distribution ; il est susceptible parce que votre ARN de guide conçoit les besoins d'être amélioré. »

La viabilité élevée d'embryon et les chercheurs très élevés de moyen de rendement de gène-retouche doivent employer moins souris et peuvent entreprendre plusieurs expériences transgéniques simultanément.

Découverte accidentelle

Dans son laboratoire, il étudie les petits morceaux du microRNA appelé d'ARN, qui modifient comment l'ADN est transcrit et règle ainsi des procédés importants à l'intérieur d'une cellule. Quelques types de cancer ont été liés aux problèmes avec le miRNA.

Recherchant une voie plus simple de produire les souris transgéniques pour étudier ces processus de régulation, le boursier post-doctoral Andrew Modzelewski a vérifié l'électroperméabilisation pour voir s'il pourrait obtenir des oeufs à reprennent plus facilement le Cas9 ARNm et l'ARN de guide. En dépit de la réussite apparente d'autres chercheurs avec l'ARNm, ses tentatives initiales étaient infructueuses. Une soirée, se trouvant hors de l'ARNm et ne voulant pas gaspiller les embryons disposés, il a emprunté CRISPR-Cas9 la protéine à un laboratoire voisin, composés assemblés de RNP et electoporated les au lieu.

« Cela a fonctionné comme la magie depuis, » il a dit. « Vous ne penseriez jamais que ceci fonctionnerait, parce que Cas9 est une molécule gigantesque. J'ai été étonné qu'une protéine si énorme pourrait electroporated efficacement. »

Tandis que la plupart des universités ont les laboratoires transgéniques où des microinjections sont exécutés, l'électroperméabilisation simplifie assez la procédure que les différents laboratoires pourraient éventuellement la faire eux-mêmes, il a prévu.

Source:

University of California - Berkeley