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Il nuovo metodo di CRISPR-EZ fa il genoma che modifica molto più facile in mouse

L'università di California, scienziati di Berkeley ha messo a punto un metodo più rapido e più efficiente alterare i geni dei mouse con CRISPR-Cas9, semplificanti una procedura che cresce nella popolarità a causa della facilità di per mezzo di nuovo strumento gene-modificante.

Mentre CRISPR-Cas9 ha ritirato l'attenzione mondiale a causa del suo potenziale di correggere le malattie ereditarie semplici in esseri umani, i ricercatori di base sono eccitati circa la sua capacità di aiutarli per capire le cause e per sviluppare i trattamenti per le malattie più complesse, compreso cancro e demenza.

per fare che, devono tramortire o modificare i geni specifici negli animali da laboratorio - in particolare, mouse - e vedere che cosa va storto. L'odierno sistema monetario aureo per la creazione queste “espulsioni„ o “dei knockins„ è di modificare i geni dentro le cellule staminali embrionali del mouse, usa queste celle per creare i mouse del mosaico e poi incrocia i mouse per ottenere uno sforzo genetico puro. A causa di capacità di CRISPR-Cas9 di alterare o sostituire precisamente i geni, modificare sempre più sta facendo direttamente nell'uovo fertilizzato, o in embrione in anticipo.

Il nuovo metodo, chiamato CRISPR-EZ (elettroporazione di CRISPR RNP degli zygotes), rende il genoma che modifica negli embrioni del mouse ancora più facile.

“Le comprensioni fondamentali chiave circa il significato biologico di un gene vengono solitamente dagli studi in vivo gene-modificare, in cui generate i mouse con un gene alterato,„ hanno detto il ricercatore Lin del cavo lui, un professore associato di Uc Berkeley di molecolare e biologia cellulare. “Ma è un impegno importante per fare un'espulsione novella con assistenza tecnica del genoma. Penso questa tecnologia potrebbe notevolmente diminuire l'ostacolo tecnico per questo tipo di sforzo e che permetta che la gente metta a fuoco più sulla scienza piuttosto che sia consumato tramite il trattamento geneticamente di organizzazione dei mouse.„

Il nuovo metodo, descritto nell'edizione di questa settimana del giornale della biochimica, ottiene intorno ad un grave ostacolo che richiede tempo nella creazione dei mouse knockout: facendo uso dei aghi di stampa microscopici per iniettare gene-modificare le molecole in un uovo fertilizzato.

I ricercatori di Uc Berkeley hanno trovato che una tecnica di laboratorio semplice ha chiamato molto meglio gli impianti di elettroporazione, permettendoli di inserire le molecole gene-modificare CRISPR-Cas9 negli embrioni con quasi 100 per cento di successo. L'elettroporazione usa una scossa dell'elettricità per creare i fori negli embrioni attraverso cui le molecole possono entrare.

Facendo uso di CRISPR-EZ in un esperimento pilota, è gruppo con successo interrotto entrambe le copie di un gene dell'obiettivo in 88 per cento dei mouse. La procedura ha generato un numero molto maggiore di mouse modificati confrontati al microinjection di CRISPR, in gran parte dovuto un miglioramento significativo nell'attuabilità dell'embrione. CRISPR-EZ è una metodologia semplice e redditizia e può essere eseguito su molti embrioni immediatamente e miliseconds delle prese soltanto, ha detto.

“Nell'esperienza non troppo distante, costerebbe almeno $25.000 e richiederebbe almeno 6 mesi per fare un mouse knockout,„ ha detto Russell Vance, un professore di Uc Berkeley di molecolare e biologia cellulare e Direttore del laboratorio di ricerca sul cancro, in cui il lavoro transgenico del mouse è stato realizzato. “Con CRISPR e miglioramenti quali CRISPR-EZ, i costi ed il tempo entrambi sono caduto almeno 10 volte. Queste innovazioni tecniche rendono al mouse uno strumento ancor più potente per la modellistica delle malattie umane.„

Il gruppo di Uc Berkeley ora sta funzionando con parecchi impianti transgenici del mouse nelle speranze che adotteranno e migliorare questa tecnica di elettroporazione, che sospetta egualmente semplificherà la creazione di altri mammiferi transgenici.

Le espulsioni richiedono il gruppo di IVF

La creazione dei mouse transgenici richiede in un gruppo esperto di fertilizzazione in vitro. Le iniezioni dell'ormone di uso dei tecnici per preparare le femmine per l'accoppiamento, dopo di che essi raccolgono le uova fertilizzate e, prima che le uova comincino dividersi, per iniettarle uno alla volta facendo uso di un ago di stampa fine. Corrente, i tecnici iniettano due molecole del RNA - RNA messaggero (mRNA), che codifica per la proteina Cas9 e RNA della guida, che fornisce l'indirizzo per l'obiettivo di CRISPR-Cas9 - e sperano che il mRNA sia tradotto correttamente in proteina Cas9 e che la proteina si combina correttamente con il RNA della guida.

Gli embrioni costruiti sono impiantati in un mouse erroneamente incinto, in cui essi gestate per i circa 20 giorni prima della nascita. Dato all'embrione inevitabile le morti durante l'iniezione e l'omissione degli embrioni di impiantare o andare definire, la tariffa della in tensione-nascita è bassa, ha detto.

“La percentuale reale dei nati vivi dagli embrioni iniettati è intorno 10 - 15 per cento per la maggior parte dei impianti transgenici, che è un problema con la procedura,„ lei ha detto. “A volte la gente raccoglie appena più di 100 embrioni per generare uno o due mouse con il gene desiderabile che modifica.„

L'elettroporazione sembra fare meno danneggiamento degli embrioni che il microinjection: fra 30 e 50 per cento degli embrioni ha provocato i nati vivi.

Apparentemente, anche, inserire le molecole premontate CRISPR-Cas9 nell'uovo fertilizzato è un più modo efficace di modificare i geni che iniettando due molecole - il RNA della guida e del mRNA - e sperando che auto-montino correttamente. Dei nati vivi, 88 per cento dei mouse hanno avuti entrambe le copie del gene dell'obiettivo modificato - un più alto indice di successo che usuale per le procedure transgeniche, ha detto.

Per una procedura più complessa - modificando una breve sequenza del DNA all'interno di un gene - il metodo era riuscito 42 per cento del tempo in un esperimento pilota.

“Con così alto indice di successo, potete usare questo per verificare molto rapidamente la vostra guida RNAs,„ ha detto. “Se il vostro CRISPR-EZ non funziona, non è a causa della consegna; è probabile perché la vostra progettazione del RNA della guida deve essere migliorata.„

L'alta attuabilità dell'embrione ed i ricercatori medi gene-modificare molto alti di risparmio di temi devono utilizzare meno mouse e possono eseguire simultaneamente parecchi esperimenti transgenici.

Scoperta accidentale

Nel suo laboratorio, studia i piccoli bit di microRNA chiamato RNA, che modificano come il DNA è trascritto e così gestiscono i trattamenti importanti dentro una cella. Alcuni tipi di cancri sono stati collegati ai problemi con miRNA.

Cercando un modo più semplice creare i mouse transgenici per studiare questi trattamenti regolatori, il collega postdottorale Andrew Modzelewski ha verificato l'elettroporazione per vedere se potesse ottenere le uova a più facilmente prende il Cas9 mRNA ed il RNA della guida. Malgrado il successo evidente di altri ricercatori con il mRNA, i suoi tentativi iniziali erano infruttuosi. Una sera, trovantesi dal mRNA e non volente sprecare gli embrioni pronti, ha preso in prestito CRISPR-Cas9 la proteina da un laboratorio vicino, complessi montati di RNP e electoporated loro invece.

“Ha funzionato come magia fin da,„ ha detto. “Non pensereste mai che questo funzionasse, perché Cas9 è una molecola gigantesca. Sono stato sorpreso che così proteina enorme potrebbe essere electroporated efficientemente.„

Mentre la maggior parte delle università hanno laboratori transgenici in cui i microinjections sono eseguiti, l'elettroporazione semplifica la procedura abbastanza che i diversi laboratori potrebbero finalmente farlo stessi, lei ha predetto.

Source:

University of California - Berkeley