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O método novo de CRISPR-EZ faz o genoma que edita muito mais fácil nos ratos

Os cientistas do University of California, Berkeley desenvolveram um método mais rápido e mais eficiente alterar os genes dos ratos com CRISPR-Cas9, simplificando um procedimento que cresce na popularidade devido à facilidade de usar a ferramenta deedição nova.

Quando CRISPR-Cas9 desenhar a atenção mundial devido a seu potencial corrigir doenças hereditárias simples nos seres humanos, os pesquisadores básicos são entusiasmado sobre sua capacidade para ajudá-los a compreender as causas e a desenvolver tratamentos para umas doenças mais complexas, incluindo o cancro e a demência.

Para fazer que, precisam de bater para fora ou alterar genes específicos em animais de laboratório - em particular, ratos - e de ver o que vai awry. A bandeira de ouro de hoje para criar estes “KO” ou “knockins” é editar os genes dentro das células estaminais embrionárias do rato, usa estas pilhas para criar ratos do mosaico, e cruza então os ratos para obter uma tensão genética pura. Devido à capacidade de CRISPR-Cas9 para alterar ou substituir precisamente genes, a edição está sendo feita cada vez mais directamente no ovo fertilizado, ou no embrião adiantado.

O método novo, chamado CRISPR-EZ (electroporation de CRISPR RNP dos zygotes), facilita o genoma que edita em embriões do rato mesmo.

“As introspecções fundamentais chaves sobre o significado biológico de um gene vêm geralmente dos estudos in vivo deedição, em que você gera ratos com um gene alterado,” disseram o pesquisador Lin do chumbo ele, um professor adjunto de Uc Berkeley de molecular e biologia celular. “Mas é um comprometimento principal para fazer um KO novo com engenharia do genoma. Eu penso esta tecnologia poderia extremamente reduzir o obstáculo técnico para este tipo de esforço e permitirá que os povos se centrem mais sobre a ciência um pouco do que seja consumido pelo processo genetically de projetar ratos.”

O método novo, descrito na introdução desta semana do jornal da química biológica, obtem em torno de um gargalo demorado em criar ratos do KO: usando agulhas microscópicas para injectar a gene-edição de moléculas em um ovo fertilizado.

Os pesquisadores de Uc Berkeley encontraram que uma técnica de laboratório simples chamou trabalhos do electroporation muito melhor, permitindo que introduzam as moléculas CRISPR-Cas9 deedição em embriões com quase 100 por cento de sucesso. O Electroporation usa uma sacudida da electricidade para criar furos nos embriões através de que as moléculas podem entrar.

Usando CRISPR-EZ em uma experiência piloto, é equipe interrompida com sucesso ambas as cópias de um gene do alvo em 88 por cento dos ratos. O procedimento gerou um número muito maior de ratos editados comparados ao microinjection de CRISPR, pela maior parte devido a uma melhoria significativa na viabilidade do embrião. CRISPR-EZ é uma metodologia simples e eficaz na redução de custos, e pode ser executado em muitos embriões imediatamente e miliseconds das tomadas somente, disse.

“No passado não demasiado distante, custaria pelo menos $25.000 e tomaria pelo menos 6 meses para fazer um rato do KO,” disse Russell Vance, um professor de Uc Berkeley de molecular e biologia celular e director do laboratório de investigação do cancro, onde o trabalho transgénico do rato foi executado. “Com CRISPR, e melhorias tais como CRISPR-EZ, os custos e o tempo ambos deixaram cair pelo menos 10 vezes. Estas inovações técnicas fazem ao rato uma ferramenta ainda mais poderosa para modelar doenças humanas.”

O grupo de Uc Berkeley está trabalhando agora com diversas facilidades transgénicas do rato nas esperanças que adotará e para melhorar esta técnica do electroporation, que suspeita igualmente simplificará a criação de outros mamíferos transgénicos.

Os KO exigem a equipe de IVF

Criar ratos transgénicos exige in vitro uma equipe especializada da fecundação. As injecções da hormona do uso dos técnicos para preparar as fêmeas para acoplar-se, depois do qual colhem os ovos fertilizados e, antes que os ovos comecem se dividir, para injetá-los um de cada vez que usam uma agulha fina. Actualmente, os técnicos injectam duas moléculas do RNA - RNA de mensageiro (mRNA), que codifica para a proteína Cas9, e RNA do guia, que fornece o endereço para o alvo de CRISPR-Cas9 - e esperam que o mRNA está traduzido correctamente na proteína Cas9 e que a proteína combina correctamente com o RNA do guia.

Os embriões projetados são implantados em um rato falsa grávido, onde eles gestate por aproximadamente 20 dias antes do nascimento. Dado o embrião inevitável mortes durante a injecção e a falha dos embriões implantar ou ir denominar, a taxa de natalidade é baixa, disse.

“A porcentagem real dos nascimentos dos embriões injetados é ao redor 10 a 15 por cento para a maioria de facilidades transgénicas, que é um problema com o procedimento,” ela disse. “Às vezes os povos recolhem mais de 100 embriões apenas para gerar um ou dois ratos com gene desejável que editam.”

O Electroporation parece fazer menos dano aos embriões do que o microinjection: entre 30 e 50 por cento dos embriões conduziu aos nascimentos.

Aparentemente, também, introduzir as moléculas CRISPR-Cas9 pre-montadas no ovo fertilizado é mais modo eficaz editar genes do que injetando duas moléculas - o RNA do mRNA e do guia - e esperando que auto-montam correctamente. Dos nascimentos, 88 por cento dos ratos tiveram ambas as cópias do gene do alvo editado - uma taxa de êxito mais alta do que usual para procedimentos transgénicos, disse.

Para um procedimento mais complexo - alterando uma seqüência curto do ADN dentro de um gene - o método era 42 por cento bem sucedido do tempo em uma experiência piloto.

“Com uma taxa de êxito tão alta, você pode usar este para testar muito rapidamente seu guia RNAs,” disse. “Se seu CRISPR-EZ não trabalha, não é devido à entrega; é provável porque seu projecto do RNA do guia precisa de ser melhorado.”

A viabilidade alta do embrião e os pesquisadores médios deedição muito altos da eficiência precisam de usar menos ratos e podem conduzir diversas experiências transgénicas simultaneamente.

Descoberta acidental

Em seu laboratório, estuda os bits pequenos do microRNA chamado RNA, que alteram como o ADN é transcrito e controla assim processos importantes dentro de uma pilha. Alguns tipos de cancro foram ligados aos problemas com o miRNA.

Procurando uma maneira mais simples de criar ratos transgénicos para estudar estes processos reguladores, o companheiro pos-doctoral Andrew Modzelewski testou o electroporation para ver se poderia obter ovos a pega mais facilmente o Cas9 mRNA e o RNA do guia. Apesar do sucesso aparente de outros pesquisadores com mRNA, suas tentativas iniciais eram mal sucedidas. Uma noite, encontrando-se fora do mRNA e não querendo desperdiçar os embriões preparados, pediu CRISPR-Cas9 a proteína de um laboratório vizinho, complexos montados de RNP e electoporated os pelo contrário.

“Trabalhou como a mágica depois,” disse. “Você nunca pensaria que este trabalharia, porque Cas9 é uma molécula gigantesca. Eu fui surpreendido que uma proteína tão enorme poderia ser electroporated eficientemente.”

Quando a maioria de universidades tiverem os laboratórios transgénicos onde os microinjections estão executados, o electroporation simplifica o procedimento bastante que os laboratórios individuais puderam eventualmente o fazer eles mesmos, ela previu.

Source:

University of California - Berkeley