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El nuevo método de CRISPR-EZ hace el genoma que corrige mucho más fácil en ratones

La Universidad de California, científicos de Berkeley ha desarrollado un método más rápido y más eficiente alterar los genes de ratones con CRISPR-Cas9, simplificando un procedimiento que crecía en renombre debido a la facilidad de usar la nueva herramienta gen-que corregía.

Mientras que CRISPR-Cas9 ha drenado la atención mundial debido a su potencial de corregir enfermedades hereditarias simples en seres humanos, excitan a los investigadores básicos sobre su capacidad de ayudarles para entender las causas y para desarrollar los tratamientos para enfermedades más complejas, incluyendo cáncer y demencia.

Para hacer que, necesitan eliminar o modificar genes específicos en animales de laboratorio - particularmente, los ratones - y ver qué va mal. El patrón oro de hoy para crear estos “golpes de gracia” o “knockins” es corregir los genes dentro de las células madres embrionarias del ratón, utiliza estas células para crear ratones del mosaico, y después cruza los ratones para conseguir una deformación genética pura. Debido a capacidad de CRISPR-Cas9 de alterar o de reemplazar exacto genes, el corregir se está haciendo cada vez más directamente en el huevo fertilizado, o el embrión temprano.

El nuevo método, llamado CRISPR-EZ (electroporación de CRISPR RNP de zygotes), hace el genoma que corrige en embriones del ratón incluso más fácil.

“Los discernimientos fundamentales dominantes sobre la significación biológica de un gen vienen generalmente de los estudios in vivo gen-que corrigen, en los cuales usted genera ratones con un gen alterado,” dijeron al investigador Lin del guía él, un profesor adjunto de Uc Berkeley de molecular y biología celular. “Solamente es una consolidación importante para hacer un golpe de gracia nuevo con la ingeniería del genoma. Pienso esta tecnología podría reducir grandemente la barrera técnica para este tipo de esfuerzo y permitirá que la gente se centre más en la ciencia bastante que sea consumido por el proceso genético de dirigir ratones.”

El nuevo método, descrito en la aplicación de esta semana el gorrón de la química biológica, consigue alrededor de un atascamiento que toma tiempo en crear ratones knockout: usando las agujas microscópicas para inyectar gen-corregir las moléculas en un huevo fertilizado.

Los investigadores de Uc Berkeley encontraron que una técnica de laboratorio simple llamó trabajos de la electroporación mucho mejor, permitiendo que inserten las moléculas gen-que corregían CRISPR-Cas9 en embriones con el casi 100 por ciento de éxito. La electroporación utiliza una sacudida de la electricidad para crear los orificios en los embriones a través de los cuales las moléculas pueden entrar.

Usando CRISPR-EZ en un experimento experimental, él es personas con éxito rotas ambas copias de un gen del objetivo en el 88 por ciento de los ratones. El procedimiento generó un número mucho mayor de ratones corregidos comparados al microinjection de CRISPR, en gran parte debido a una mejoría importante en viabilidad del embrión. CRISPR-EZ es una metodología simple y de poco costo, y se puede realizar en muchos embriones inmediatamente y los miliseconds de las tomas solamente, él dijo.

“En el pasado no demasiado distante, costaría por lo menos $25.000 y tardaría por lo menos 6 meses para hacer un ratón knockout,” dijo Russell Vance, profesor de Uc Berkeley de molecular y biología celular y director del laboratorio de investigación de cáncer, en donde el trabajo transgénico del ratón fue realizado. “Con CRISPR, y mejorías tales como CRISPR-EZ, los costos y tiempo ambos han caído por lo menos diez veces. Estas innovaciones técnicas hacen el ratón una herramienta aún más potente para modelar enfermedades humanas.”

El grupo de Uc Berkeley ahora está trabajando con varias instalaciones transgénicas del ratón en esperanzas que él adoptará y perfeccionar esta técnica de la electroporación, que ella sospecha también simplificará la creación de otros mamíferos transgénicos.

Los golpes de gracia requieren a las personas de IVF

Crear ratones transgénicos requiere a personas expertas de la fertilización in vitro. Las inyecciones de la hormona del uso de los técnicos para preparar a las hembras para aparear, después de lo cual ellas cosechan los huevos fertilizados y, antes de que los huevos comiencen a dividir, para inyectarlos uno a la vez usando una aguja fina. Actualmente, los técnicos inyectan dos moléculas del ARN - ARN de mensajero (mRNA), que cifra para la proteína Cas9, y el ARN de la guía, que ofrece el direccionamiento para el objetivo de CRISPR-Cas9 - y esperan que el mRNA está traducido correctamente a la proteína Cas9 y que la proteína combina correctamente con ARN de la guía.

Los embriones dirigidos se implantan en un ratón falso embarazada, donde ellos gestate por cerca de 20 días antes del nacimiento. Dado el embrión inevitable muertes durante la inyección y la falla de los embriones de implantar o de ir a llamar, el índice de natalidad es inferior, él dijo.

“El porcentaje real de nacimientos de embriones inyectados es el alrededor 10 a 15 por ciento para la mayoría de las instalaciones transgénicas, que es un problema con el procedimiento,” ella dijo. “La gente cerco a veces más de 100 embriones apenas para generar uno o dos ratones con el gen deseable que corrigen.”

La electroporación aparece hacer menos daño a los embriones que el microinjection: entre el 30 y 50 por ciento de los embriones dio lugar a nacimientos.

Al parecer, también, la inserción de las moléculas premontadas CRISPR-Cas9 en el huevo fertilizado es un más modo eficaz de corregir genes que inyectando dos moléculas - el ARN del mRNA y de la guía - y esperando que uno mismo-montan correctamente. De los nacimientos, el 88 por ciento de los ratones tenía ambas copias del gen del objetivo corregido - un índice de éxito más alto que usual para los procedimientos transgénicos, él dijo.

Para un procedimiento más complejo - modificando una serie corta de la DNA dentro de un gen - el método era el 42 por ciento acertado del tiempo en un experimento experimental.

“Con un tan alto índice de éxito, usted puede utilizar esto para probar su guía RNAs muy rápidamente,” ella dijo. “Si su CRISPR-EZ no trabaja, no está debido a lanzamiento; es probable porque su diseño del ARN de la guía necesita ser perfeccionado.”

La alta viabilidad del embrión y los investigadores medios muy altos de la eficiencia gen-que corrigen necesitan utilizar menos ratones y pueden conducto varios experimentos transgénicos simultáneamente.

Descubrimiento accidental

En su laboratorio, él estudia las pequeñas brocas del microRNA llamado ARN, que se modifican cómo la DNA se transcribe y controlan así procesos importantes dentro de una célula. Algunos tipos de cáncer se han conectado a los problemas al miRNA.

Buscando una manera más simple de crear ratones transgénicos para estudiar estos procesos reguladores, el becario postdoctoral Andrew Modzelewski probó la electroporación para ver si él podría conseguir los huevos a toma más fácilmente el Cas9 mRNA y el ARN de la guía. A pesar del éxito evidente de otros investigadores con el mRNA, sus tentativas iniciales eran fracasadas. Una tarde, encontrándose fuera del mRNA y no queriendo perder los embriones preparados, él pidió prestada CRISPR-Cas9 la proteína de un laboratorio vecino, complejos montados de RNP y electoporated los en lugar de otro.

“Ha trabajado como magia desde entonces,” él dijo. “Usted nunca pensaría que esto trabajaría, porque Cas9 es una molécula gigantesca. Me sorprendieron que una proteína tan enorme se podría electroporated eficientemente.”

Mientras que la mayoría de las universidades tienen laboratorios transgénicos en donde se realizan los microinjections, la electroporación simplifica el procedimiento bastante que los laboratorios individuales pudieron hacerlo eventual ellos mismos, ella predijo.

Source:

University of California - Berkeley