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Utilização NMR para investigar proteínas intrìnseca desorganizado: uma entrevista com Dr. Isabella Felli

Dr. Isabella FelliTHOUGHT LEADERS SERIES...insight from the world’s leading experts

Pode você dar uma breve vista geral de proteínas intrìnseca desorganizado (IDPs)? Em sua opinião porque é o IDPs tão significativo?

O “IDPs” é agora um acrônimo amplamente utilizado que represente “proteínas intrìnseca desorganizado.” É o termo usado geralmente pela comunidade científica para referir uma grande variedade de proteínas que não têm uma estrutura 3D estável e é caracterizado pelo contrário por uma extensão alta da mobilidade local, da desordem e dos muitos conformers que são acessíveis na temperatura ambiente.

Estas são as características toda muito peculiares que confer uma variedade de vantagens funcionais com respeito àqueles derivaram da presença das estruturas 3D bem definidas.

Focusing on IDPs at CERM

Centrar-se sobre o IDPs em CERM de AZoNetwork em Vimeo.

Por que é a pesquisa no IDPs até agora atrás da pesquisa em proteínas estruturadas?

Até aproximadamente 15 anos há, estas proteínas não foram consideradas muito, embora existissem sempre. Um exemplo é a caseína, que nós todos bebemos na manhã em que nós temos nossos cappuccinos, porque esta presente no leite.

Ferramentas que foram usadas por 50 anos para determinar as estruturas 3D tais como o raio X e a atenção NMR, atraída mais para proteínas dobradas.

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Modelo estrutural da estrutura dobrada da proteína do citocromo b5

Que diferenças na estrutura e na função o IDPs tem sobre proteínas non-intrinsically desorganizado?

Nós todos crescemos acima de leitura nos livros de texto sobre como a função de uma proteína é ligada primeiramente a sua estrutura 3D. Muitos dados produzidos desde os anos 50 sobre as estruturas 3D das proteínas foram depositados no banco de dados da proteína (PDB) e explicam muitas características sobre a função das proteínas elas mesmas.

Este pensamento do grosso da população confundiu a comunidade científica igualmente da vista em outros tipos das proteínas, as proteínas que não têm uma estrutura 3D bem definida em seu formulário nativo, mas que inter-converso entre uma variedade de conformações diferentes, com as espinhas dorsais que são pela maior parte solvente expor, altamente flexíveis e altamente desorganizado.

Parece muito simples dizê-lo agora, mas é consideravelmente óbvio que estas vantagens funcionais confer completamente diferentes muito diferentes das propriedades.

IDP_ID4

Modelo estrutural da proteína intrìnseca desorganizado ID4

Como a diferença entre estas duas classes de proteínas foi tratada dentro da comunidade científica? Como as técnicas de imagem lactente as mais atrasadas deram forma à maneira que estas proteínas foram estudadas?

Uma coisa que eu apreciei ler aproximadamente em uma revisão por nosso colega Vladimir Uversky, um dos povos que abriram este campo, era sobre alguns dos nomes que foram usados desde os anos 50 para referir estas proteínas que não eram realmente o foco principal da comunidade científica.

Encontrou uma variedade de incluir diferente dos nomes “maleável,” “combinações flexíveis” e diferentes dos termos “desorganizado,” “desdobrado” com “intrìnseca,” nativo”. Finalmente, um pouco mais de termos criativos foram usados como da “proteínas dança,” a “proteína nubla-se” e as “proteínas que esperam sócios.”

Era bom que aproximadamente dez anos há, a comunidade científica concordada com um termo geral que indicasse de algum modo amplamente esta classe de proteínas que não se dobram em uma estrutura 3D bem definida e estável, como nós fomos usados ao pensamento antes.

Ao se centrar sobre este assunto do IDPs, eu fui imprimido realmente por como todos nós sabem sou conduzido pela maior parte pela tecnologia que nós temos e que nós podemos explorar. Eu penso que esta investigação das proteínas na definição atômica dá um exemplo claro.

Nós pudemos fazer raios X dos cristais desde que, essencialmente, os anos 50 mas, por outro lado, nós não tivemos uma ferramenta para medir realmente a dinâmica na definição atômica. Os agradecimentos ao raio X e à estrutura 3D de determinação NMR em uma maneira razoavelmente fácil, a comunidade foram empurrados para centrar-se cada vez mais sobre o estudo de proteínas dobradas.

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2D HN e 2D espectros do nanômetro do ENGODO adquiridos para domínios intrìnseca desorganizado de CBP (CBP_ID4)

Ao longo dos anos, os dados acumularam no banco de dados de proteína que explica uma variedade de funções diferentes e contribuíram muito a melhorar nosso conhecimento sobre as propriedades de proteínas dobradas.

Por que NMR guardara um papel estratégico na caracterização de IDP? Que vantagens há esse NMR entrega que a outra instrumentação não pode?

Esta compreensão do grosso da população manteve a comunidade científica confundida igualmente da focalização em muitas outras proteínas importantes, tais como mais flexíveis. Nós todos sabemos a espectroscopia NMR é usada não somente para olhar a informação estrutural, mas podemos igualmente fornecer uma variedade de informação sobre a dinâmica e a flexibilidade locais, assim que pode agora jogar um papel tão estratégico no estudo do IDPs.

Pode contribuir a permitir o acesso à informação de alta resolução nestas proteínas e ajudar a encher uma diferença de aproximadamente 50 anos em termos do que nós sabemos sobre estas proteínas.

Por outro lado, para focalizar em proteínas intrìnseca desorganizado, você precisa uma alta resolução porque as propriedades das proteínas tais como a flexibilidade alta, fornecem as ressonâncias que são todas muito próximas a uma outra.

Isto conduz tipicamente ao problema de sobreposições extensivas do cruz-pico nos espectros. Conseqüentemente, os campos altos, a rotulagem isótopa e as experiências costuradas são muito importantes melhorar os métodos para estudar o IDPs.

Nós todos sabemos que que NMR é grande para fornecer estrutural e a informação dinâmica e é por isso ele é uma técnica estratégica geralmente para estudar os sistemas altamente flexíveis e dinâmicos, em particular IDPs, que são igualmente bastante complexos. Apesar disto, eu penso que nós podemos fazer muito melhor se nós pensamos sobre como estas propriedades impactam em parâmetros NMR.

Mostrar-nos-ão alguns pontos críticos que nós não temos pensado demasiado aproximadamente devido a se centrar mais sobre o estudo de proteínas dobradas. Se nós pensamos com cuidado sobre o impacto das propriedades do IDPs tais como as espinhas dorsais altamente flexíveis, os protão pela maior parte expor do amido ao solvente e seu dynamicity alto, a seguir nós podemos fazer muito para melhorar mais as experiências NMR de modo que nós possamos estudar o IDPs da complexidade crescente.

Pode você dar uma introdução na sua utilização recente da pesquisa NMR para estudar o IDPs? Que aplicações há desta pesquisa?

Nosso interesse no IDPs veio de olhar as propriedades de rotações NMR. Nós temo-nos centrado sobre a revelação dos métodos novos baseados na detecção directa do carbono 13. Este é agradecimentos a uma interacção forte com Bruker desde que, a fim se centrar sobre a detecção do carbono, a sensibilidade da instrumentação é realmente importante.

Quando nós começamos se centrar sobre o projecto, nós tentamos ver que máquina no laboratório teve a sensibilidade a mais alta do carbono. Nós fomos surpreendidos realmente que mais velha a ponta de prova, melhor a sensibilidade do carbono.

Embora surpreendente naquele tempo, fez realmente o sentido porque, ao longo dos anos, as pontas de prova foram melhoradas pela maior parte para a sensibilidade do protão um pouco do que a sensibilidade do carbono. Nós usamos conseqüentemente as pontas de prova as mais velhas para nossas primeiras experiências.

Então, trabalhando com uma interacção próxima com os povos em Bruker, com ambos os especialistas da aplicação e aqueles que trabalham na construção da ponta de prova, perguntaram nos o que deve ser melhorado.

Nós sugerimos novas aplicações e sobre muito uma excitação de 10 anos, ponto por ponto, nós controlamos ir de uma sensibilidade de 200 a 1 com carbono 13, à sensibilidade que nós temos agora, que é 2800 a 1.

Isto significa uma melhoria de um factor de 14 durante menos de 10 anos. Isso permite definida uma enorme quantidade das aplicações baseadas nesta tecnologia. Para dar apenas uma ideia em termos da quantidade de tempo que você precisa de aplicar uma experiência específica, se a sensibilidade melhora por um factor de 10, a quantidade de tempo você precisa é reduzido por um factor de 100.

Isto significa que agora, nós podemos realmente usar estas experiências baseadas na detecção do carbono, que nós temos focalizado sobre durante os últimos 10 anos, como uma ferramenta rotineira estudar geralmente proteínas. Aquele é algo que é particularmente útil para as proteínas onde você precisa alguma ferramenta elogiosa para experiências da detecção do protão.

Motivado pela necessidade para que os métodos novos focalizem em proteínas paramagnéticas, nós começamos centrar-se sobre este assunto. Aquele era tradicional o foco de CERM. Foi começado por Ivano Bertini.

Ivano, Claudio e Lucia têm a experiência vasta ao lidar com proteínas paramagnéticas, como fazem muitos de meus colegas aqui em CERM como Paola, Mario e Roberta. Inicialmente, nós fizemos muito trabalho com proteínas paramagnéticas, mas por outro lado, ao estudar as propriedades das rotações, nós realizamos que estes métodos poderiam ser interessantes, não somente para detectar sinaliza perto do centro paramagnético das proteínas, mas também, para olhar sistemas muito grandes ou para estudar o IDPs, por exemplo. Isto é como nós nos tornamos interessados no estudo do IDPs.            

Ali na placa, está um espectro do ENGODO do synuclein alfa, que é conhecido e caracterizado bem e se transformou agora meio a amostra padrão para a instalação das experiências no IDPs. É muito interessante porque envolveu na progressão de doenças neurodegenerative. Foi usado para a revelação dos métodos em nosso laboratório.

Durante os últimos 10 anos, início nos nós centramo-nos sobre nosso assunto principal da detecção directa do carbono, mas por outro lado nós aproximamos o campo do IDPs, olhando todas suas propriedades peculiares, particularmente a flexibilidade alta, pela maior parte as espinhas dorsais expor solvente e o dynamicity alto.

Nós quisemos saber como estas propriedades impactam em observables NMR e porque, porque, se você conhece aquele, a seguir você pode projectar melhores experiências alargar a escala de aplicações de NMR ao estudo do IDPs.

Que eram os aspectos que nós encontramos importante dentro do estudo do IDPs?

Um problema conhecido é sobreposição alta do cruz-pico. Nós exploramos o heteronuclei (13C e 15N) tanto quanto possível, desde que estes são caracterizados por uma dispersão mais alta da SHIFT química.

Esta era realmente a razão para o sucesso das experiências da detecção do carbono porque, no principal, você pode provar somente SHIFT químicas heteronuclear em todas as dimensões das experiências, maximizando a dispersão dos picos transversais.

Uma outra propriedade peculiar é os processos químicos muito rápidos da troca de protão do amido com o solvente. É melhor se você tenta aproximar condições fisiológicos tais como o pH neutro e a temperatura física.

Frequentemente, se os protão do amido são expor ao solvente, alargam para fora além da detecção devido a estes processos rápidos da troca com o solvente própria. Além disso, nestas circunstâncias, o carbono detectou experiências transforma-se uma ferramenta muito valiosa para recuperar a informação que, se não, seria perdida geralmente apenas quando executada com o protão do amido detectou experiências.

Este efeito da troca, por outro lado, tweaking um bit as circunstâncias, pode igualmente ser usado para acelerar a recuperação longitudinal de protão do amido. Conseqüentemente, nós podemos explorar todos os truques que têm sido propor recentemente na literatura, para reduzir a duração de experiências NMR; nós podemos reduzir o tempo onde nós precisamos de esperar entre a execução de duas experiências sucessivas. Este é o método rápido assim chamado e aquele pode igualmente ser aplicado ao estudo do IDPs.

Finalmente, provavelmente a medida ou o ingrediente importante poder endereçar o estudo do IDPs cada vez mais complexo, são aquela de usar experiências multi-dimensionais com a extensibilidade mais alta de 3. Esta maneira, nós podemos espalhar para fora cada vez mais os cruz-picos cada vez mais em dimensões a fim reduzir as possibilidades da sobreposição acidental do cruz-pico.

Para isto, uma variedade de aproximações agradáveis foram propor na literatura. Eu penso que esses que estimularam realmente o uso prático destas experiências eram aqueles que deram ao usuário uma forma facil visualizar estes objetos altamente dimensionais.

Eu devo admitir que, pessoal, eram um bit assustador para mim; Eu sou usado a tratar o 3D. Olhando os espectros 3D, eu fui tranquilizado, mas quando eu estava pensando sobre a vista de 4D ou de 5D, inicialmente eu era consideravelmente céptico.

Foi estimulado igualmente por este projecto bio-NMR do acesso (www.bionmr.net) esse nós focalizou sobre nos últimos anos e igualmente agradecimentos a, por exemplo, colaborações com Bernhard Brutscher e Wiktor Koźmiński que nós temos estabelecido agora uma série completa das experiências NMR que são baseadas na detecção do carbono ou na detecção do protão. Isso permite-nos agora de focalizar nas proteínas tão complexas quanto 400 ácidos aminados, por exemplo.

Como pode o IDPs afectar a predominância de desordens genéticas? Que papel jogam dentro do proteome humano e diseasome?

Nós começamos trabalhar no IDPs olhando o alfa-synuclein, que é muito interessante. Envolveu no início de doenças neurodegenerative mas eu devo admiti-lo, em nossas mãos, era apenas a proteína do ANIMAL DE ESTIMAÇÃO IDP a ser usada como uma amostra padrão para a instalação de experiências NMR e tentar e desenvolver experiências novas.

Nós queremos usar todas estas experiências para caracterizar proteínas novas. Um dos campos gerais onde podem ser aplicados é esse que nós começamos de, que é proteínas virais. As proteínas virais têm um genoma razoavelmente pequeno, assim que precisam de fazer o bom uso de sua informação em termos de codificar as funções específicas associadas com os bits diferentes dos ácidos aminados.

A ideia da desordem e dos motivos pequenos da interacção codificados apenas por alguns ácidos aminados, agora referidos geralmente como SLiMs (motivos lineares curtos), é uma estratégia muito atraente para que um vírus use uma seqüência de ácido aminado razoavelmente compacta e codifique esta seqüência com uma variedade de funções diferentes.

Geralmente, a desordem intrínseca é muito abundante em proteínas virais e nós temos estudado duas proteínas, um E7 chamado do vírus de papiloma humano - um vírus oncogenic - e um E1A chamado do vírus adenóide, uma proteína homólogo ao E7. Estas são duas proteínas expressadas nas fases adiantadas de infecção viral.

É surpreendente que apenas estas correntes bastante compactas do polipeptídeo (um é menos de 100 ácidos aminados, o outro menos de 300) podem contratar em uma variedade enorme de interacções com proteínas da pilha de anfitrião.

Para cotar a expressão de uma os papéis da chave neste assunto, podem “sequestrar regulamentos da pilha.” Este é um dos assuntos que nós temos focalizado sobre e agora nós estamos a ponto de publicar os primeiros resultados neste campo.

Uma outra área onde estes métodos possam se tornar realmente úteis é o estudo dos linkers flexíveis assim chamados. Nós centramo-nos sobre este assunto em colaboração com Peter Tompa. Frequentemente, quando nós olhamos machineries moleculars complexos, são constituídos frequentemente por diversos módulos que são dobrados, conectados por estes linkers flexíveis.

Este é o caso com muitos factores da transcrição, por exemplo. Um deles, CBP, é aproximadamente 2.500 ácidos aminados e os domínios dobrados foram caracterizados ao longo dos anos, que explicou muito sobre a função da proteína.

Por outro lado, sobre a metade da corrente do polipeptídeo não é dobrado, tão de algum modo ele está em um estado intrìnseca desorganizado. Seria bastante um desperdício se a natureza tinha usado a metade da seqüência de ácido aminado para se comportar apenas como cordas entre unidades dobradas.

Conseqüentemente, outro um projecto que nós estamos focalizando sobre é a caracterização dos fragmentos intrìnseca desorganizado desta proteína, para tentar para fora e figurar se são realmente apenas cordas ou se há outros elementos funcionais codificados nestes pedaços flexíveis de proteínas.

Contudo, esta parece ser uma propriedade muito geral de proteínas complexas e esta conduz-me ao assunto final onde eu penso que NMR pode fazer uma contribuição agradável. Que vimos do estudo de fragmentos intrìnseca desorganizado pequenos de um outro factor importante da transcrição, o receptor do andrógeno, um assunto nós focalizou sobre em colaboração com Xavier Salvatella.

Esta é igualmente uma proteína complexa, para que nós focalizamos nos primeiros 150 ácidos aminados. Parece não tão interessante, apenas um bit pequeno de uma proteína complexa, mas, esta é a peça onde há uma possibilidade que as cinco glutamina expandem e aumentam em número, quando a doença progride.

Estas doenças são chamadas doenças do polyQ porque estes fragmentos neste primeiro bit que nós estamos estudando, quando a doença progride, se tornam caracterizados por 20, 25, 30 ou 35 glutamina em seguido. Estes pedaços não se cristalizam, tão lá não é sabido muito sobre suas propriedades de alta resolução e como estes são ligados ao início da doença.

Se você pensa em termos da utilização NMR para olhar uma peça que tivesse 30 Qs em seguido, no início, nós pensamos que nós nunca poderíamos a caracterizar. É uma seqüência altamente repetitiva.

Neste contexto, os métodos que se têm tornado recentemente que foco no IDPs para conseguir a alta resolução e caracterizar os sistemas flexíveis, permitidos nos para caracterizar este primeiro segmento, que incluiu estas 25 glutamina em seguido. Você pode então usar estes dados para tentar explicar as razões estes ácidos aminados a seguir causa diversas doenças.

Um exemplo conhecido de uma destas doenças do polyQ é a doença de Huntington. A origem molecular é a mesma; um fragmento dos alguns Qs que se torna então mais por muito tempo e mais por muito tempo. A proteína que nós focalizamos está ligada o fragmento do N-terminal do receptor do andrógeno.

O mau funcionamento causa a doença chamada SBMA (atrofia muscular espinal e bolbosa), que é uma doença rara. Soube para ser relacionado ao oligomerization destes fragmentos do polyQ. Mais o Qs lá é, mais estas proteínas tendem a agregar em vez de permanecer em seu estado nativo fisiológico e aquela causam a doença.

Este é, outra vez, um campo onde NMR pode fornecer introspecções realmente tremendas porque, naturalmente, é proteínas desorganizado e os agradecimentos aos métodos recentemente desenvolvidos, um podem superar as limitações que se derivam da sobreposição alta destas seqüências altamente repetitivas.

Nós temo-nos centrado sobre este projecto da detecção do carbono desde 2003, quando nós obtivemos a primeira ponta de prova com sensibilidade melhorada para a detecção do carbono. Nós começamos olhando neste assunto e, em etapas pequenas, chegamos em desenvolver um grupo inteiro de experiências multi-dimensionais detectadas carbono que estão realmente na liberação de Bruker.

Isto é em colaboração com Wolfgang Bermel, Rainer Kümmerle, que foi sempre parte deste projecto em uma equipe com meu colega Roberta Pieratelli. Eu compartilhei de todo o trabalho que eu tenho falado aproximadamente com ela, assim que eu devo dar-lhe o crédito também.

Ao mover nossa muita atenção ao IDPs, nós igualmente centramo-nos sobre os métodos que foram baseados não somente na detecção do carbono, mas tentado combinar os métodos os mais úteis baseou na detecção do protão do amido e também eventualmente, na detecção do protão de Hα que não é afectada pela troca.

Agora, eu penso que uma série completa de experiências multi-dimensionais está disponível e pode facilmente ser executada com software recente para fornecer realmente muita introspecção no estudo do IDPs. Permite que nós estudem sistemas razoavelmente complexos.

Que o futuro guardara para sua pesquisa e pesquisa no IDPs? Como você usará o equipamento NMR de Bruker em sua pesquisa futura?

Quando nós começamos neste assunto, os sistemas os maiores caracterizados eram 100 a 150 ácidos aminados por muito tempo, visto que, agora, há diversos exemplos do IDPs enquanto 400 ácidos aminados que mostram que este pode realmente ser caracterizado na definição atômica. E assim, por que não?

Talvez, quando nós temos os 1,2 gigahertz, nós controlaremos pensar sobre a caracterização do IDPs tão complexo quanto, talvez, 1000 ácidos aminados e contribuir cada vez mais a este campo emocionante.

Desde que nós temos devotado tanto a atenção ao assunto da detecção do carbono, seria realmente grande ver algum planeamento de algumas revelações em 1,2 gigahertz porque o campo magnético aumentado seria um benefício óbvio.

Seria muito interessante ver como o carbono detectou experiências para executar em uns campos mais altos. A detecção do carbono tem uma sensibilidade mais baixa no que diz respeito à detecção do protão, mas igualmente tem algumas vantagens. Por exemplo, você não precisa de suprimir o sinal solvente.

Não há uns efeitos prejudiciais grandes da concentração iónica mais alta usada geralmente para estudar tão talvez algum IDPs e, seria uma forma facil para que Bruker tente as novas tecnologias e ver se nós podemos fazer, nos próximos 10 anos, um outro salto de um factor de 10, que, naturalmente, ser apreciado muito.

Onde podem os leitores encontrar mais informação?

Uma vista geral em minha actividade da pesquisa e do ensino, minha página de CERM

A tecnologia NMR e as aplicações de Bruker

Sobre o Dr. Isabella FelliISABELLA FELLI

Eu sou Isabella Felli. Eu tenho trabalhado aqui em CERM desde minha tese do universitário em 1993 sob o guia do professor Ivano Bertini, meu mentor quando eu comecei no campo de NMR. Realmente criou em CERM um ambiente científico muito de estimulação e começou esta muito grande infra-estrutura da pesquisa que tem onze instrumentos e tem fornecido agora o acesso aos usuários externos pelo mundo inteiro depois, principalmente a Europa, mas pelo mundo inteiro.

Eu sou muito orgulhoso ter uma possibilidade usar todos os instrumentos bonitos que estão disponíveis aqui em Florença e, também, ser envolvido em uma variedade de projectos diferentes que centram-se sobre a revelação de métodos NMR. Eu sou estimulado igualmente por todo o feedback que nós obtemos dos usuários externos.

Citations

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    Bruker BioSpin - NMR, EPR and Imaging. (2020, December 17). Utilização NMR para investigar proteínas intrìnseca desorganizado: uma entrevista com Dr. Isabella Felli. News-Medical. Retrieved on October 19, 2021 from https://www.news-medical.net/news/20160630/Using-NMR-to-investigate-intrinsically-disordered-proteins-an-interview-with-Dr-Isabella-Felli.aspx.

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    Bruker BioSpin - NMR, EPR and Imaging. 2020. Utilização NMR para investigar proteínas intrìnseca desorganizado: uma entrevista com Dr. Isabella Felli. News-Medical, viewed 19 October 2021, https://www.news-medical.net/news/20160630/Using-NMR-to-investigate-intrinsically-disordered-proteins-an-interview-with-Dr-Isabella-Felli.aspx.