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Usando el RMN para investigar las proteínas intrínseco desordenadas: una entrevista con el Dr. Isabel Felli

Dr. Isabella FelliTHOUGHT LEADERS SERIES...insight from the world’s leading experts

(IDPs)¿Puede usted dar una reseña abreviada de proteínas intrínseco desordenadas? ¿En su opinión porqué es el IDPs tan importante?

El “IDPs” ahora es las siglas ampliamente utilizadas que representan “proteínas intrínseco desordenadas.” Es el término usado generalmente por la comunidad científica para referir a una amplia variedad de proteínas que no tengan una estructura estable 3D y en lugar de otro es caracterizado por un alto fragmento de la movilidad local, del desorden y de muchos conformers que son accesibles en la temperatura ambiente.

Éstas son las características todo muy peculiares que consultan ellos una variedad de ventajas funcionales por lo que se refiere a ésas derivadas de la presencia de las estructuras bien definidas 3D.

Focusing on IDPs at CERM

El centrarse en el IDPs en CERM de AZoNetwork en Vimeo.

¿Por qué está la investigación en el IDPs hasta ahora detrás de la investigación en las proteínas estructuradas?

Hasta hace aproximadamente 15 años, estas proteínas no eran consideradas mucho, aunque hayan existido siempre. Un ejemplo es la caseína, que todos bebemos por la mañana en que tenemos nuestro capuchino, pues está presente en leche.

Herramientas que se han utilizado por 50 años para determinar las estructuras 3D tales como radiografía y RMN, atención atraída más hacia las proteínas dobladas.

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Modelo estructural de la estructura doblada de la proteína del citocromo b5

¿Qué diferencias en estructura y la función el IDPs tiene sobre las proteínas non-intrinsically desordenadas?

Todos crecimos de estudio en libros de texto sobre cómo la función de una proteína se conecta sobre todo a su estructura 3D. Muchos datos presentados desde los años 50 sobre las estructuras 3D de proteínas se han depositado en el banco de datos de la proteína (PDB) y explican muchas características sobre la función de las proteínas ellos mismos.

Este pensamiento de la corriente principal distrajo a la comunidad científica también de observar en otras clases de proteínas, las proteínas que no tienen una estructura bien definida 3D en su forma nativa, pero que inter-convertido entre una variedad de diversas conformaciones, con las espinas dorsales que son en gran parte disolvente expuesto, altamente flexibles y altamente desordenadas.

Parece muy simple ahora decirlo, pero es bastante obvio que consultan estas propiedades muy diversas ventajas funcionales totalmente diversas.

IDP_ID4

Modelo estructural de la proteína intrínseco desordenada ID4

¿Cómo la diferencia entre estas dos clases de proteínas fue tratada dentro de la comunidad científica? ¿Cómo las últimas técnicas de proyección de imagen han dado forma la manera que estas proteínas se han estudiado?

Una cosa que gocé el leer alrededor en una revista de nuestro colega Vladimir Uversky, una de la gente que abrió este campo, estaba sobre algunos de los nombres que se han utilizado desde los años 50 para referir a estas proteínas que no eran realmente el foco principal de la comunidad científica.

Él encontró una variedad de diversos nombres incluyendo “maleable,” “combinaciones plegables” y diversas de los términos “desordenados,” “revelado” con “intrínseco,” natural”. Finalmente, más términos creativos fueron utilizados por ejemplo las “proteínas del baile,” la “proteína se nubla” y las “proteínas que esperan a socios.”

Era bueno que hace aproximadamente diez años, la comunidad científica estada de acuerdo con un término general que indicaría de alguna manera ampliamente esta clase de las proteínas que no doblan en una estructura bien definida y estable 3D, como nos utilizaron al pensamiento antes.

Mientras que se centraba en este tema del IDPs, me creé una diferencia de potencial realmente cómo todo nosotros sabe soy impulsado en gran parte por la tecnología que tenemos y que podemos explotar. Pienso que esta investigación de proteínas en la resolución atómica da un ejemplo sin obstrucción.

Hemos podido hacer radiografías de cristales desde que, esencialmente, los años 50 sino, por otra parte, nosotros no teníamos una herramienta para medir realmente dinámica en la resolución atómica. Los gracias a la radiografía y el RMN que determinaba la estructura 3D de una manera bastante fácil, la comunidad fueron activados para centrarse cada vez más en el estudio de proteínas dobladas.

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2.o HN y 2.os espectros del nanómetro de la ESTAFA detectados para los dominios intrínseco desordenados de CBP (CBP_ID4)

A lo largo de los años, los datos han acumulado en el banco de datos de proteína que explica una variedad de diversas funciones y han contribuido mucho a perfeccionar nuestro conocimiento sobre las propiedades de proteínas dobladas.

¿Por qué el RMN lleva a cabo un papel estratégico en la caracterización de IDP? ¿Qué ventajas hay ese RMN entrega que no puede la otra instrumentación?

Esta comprensión de la corriente principal mantuvo a la comunidad científica distraída también de centrarse en muchas otras proteínas importantes, tales como las más flexibles. Todos sabemos la espectroscopia del RMN no sólo se utiliza para observar la información estructural, pero podemos también ofrecer una variedad de información sobre dinámica y adaptabilidad locales, así que puede ahora desempeñar un papel tan estratégico en el estudio del IDPs.

Puede contribuir a habilitar el acceso a la información de alta resolución sobre estas proteínas y ayudar a llenar un entrehierro de cerca de 50 años en términos de lo que sabemos sobre estas proteínas.

Por otra parte, para centrarse en las proteínas intrínseco desordenadas, usted necesita una alta resolución porque las propiedades de las proteínas tales como alta adaptabilidad, ofrecen las resonancias que son todas muy cercanas a otra.

Esto lleva típicamente al problema de los recubrimientos extensos del cruz-pico en los espectros. Por lo tanto, los altos campos, la etiqueta isotópica y los experimentos adaptados son muy importantes perfeccionar los métodos para estudiar el IDPs.

Todos sabemos que el RMN es grande para ofrecer estructural y la información dinámica y por eso él es una técnica estratégica en general para estudiar sistemas altamente flexibles y dinámicos, particularmente IDPs, que son también muy complejos. A pesar de esto, pienso que podemos hacer mucho mejor si pensamos en cómo estas propiedades afectan parámetros del RMN.

Nos mostrarán algunos puntos críticos que no hemos estado pensando demasiado alrededor de debido a centrarse más en el estudio de proteínas dobladas. Si pensamos cuidadosamente en el impacto de las propiedades del IDPs tales como las espinas dorsales altamente flexibles, los protones en gran parte expuestos de la amida al disolvente y su alto dynamicity, después podemos hacer mucho para perfeccionar más lejos los experimentos del RMN de modo que poder estudiar el IDPs de la complejidad cada vez mayor.

¿Puede usted dar una introducción en su investigación reciente usando el RMN para estudiar el IDPs? ¿Qué usos hay de esta investigación?

Nuestro interés en el IDPs vino de observar las propiedades de las barrenas del RMN. Nos hemos estado centrando en el revelado de los nuevos métodos basados en la detección directa del carbono 13. Éste es gracias a una acción recíproca fuerte con Bruker puesto que, para centrarse en la detección del carbono, la sensibilidad de la instrumentación es realmente importante.

Cuando comenzamos a centrarnos en el proyecto, intentamos ver qué máquina en el laboratorio tenía la sensibilidad más alta del carbono. Nos sorprendieron realmente que cuanto más vieja es la antena, mejor es la sensibilidad del carbono.

Aunque sea asombrosamente en ese entonces, tuviera real sentido porque, a lo largo de los años, las antenas se han perfeccionado en gran parte para la sensibilidad del protón bastante que sensibilidad del carbono. Por lo tanto utilizamos las más viejas antenas para nuestros primeros experimentos.

Entonces, trabajando con una acción recíproca cercana con la gente en Bruker, con ambos especialistas del uso y ésos trabajando en la construcción de la antena, nos preguntaron qué debe ser perfeccionada.

Sugerimos nuevas aplicaciones y sobre muy una excitación de 10 años, paso a paso, manejamos ir de una sensibilidad de 200 a 1 con el carbono 13, a la sensibilidad que ahora tenemos, que es 2800 a 1.

Esto significa una mejoría de un factor de 14 durante menos de 10 años. Eso habilita definitivamente una enorme cantidad de usos basados en esta tecnología. Apenas para dar una idea en términos de periodo de tiempo que usted necesita aplicar un experimento específico, si la sensibilidad perfecciona por un factor de 10, el periodo de tiempo usted necesita es reducido por un factor de 100.

Esto significa que ahora, podemos utilizar realmente estos experimentos basados en la detección del carbono, que hemos estado enfocando conectado durante los 10 años pasados, como herramienta rutinaria para estudiar las proteínas en general. Ése es algo que es determinado útil para las proteínas donde usted necesita un poco de herramienta elogiosa para los experimentos de la detección del protón.

Motivado por la necesidad de nuevos métodos de centrarse en las proteínas paramagnéticas, comenzamos a centrarnos en este tema. Ése era tradicionalmente el foco de CERM. Fue comenzado por Ivano Bertini.

Ivano, Claudio y Lucía tienen experiencia extensa haciendo frente a las proteínas paramagnéticas, al igual que muchos de mis colegas aquí en CERM como Paola, Mario y Roberta. Inicialmente, hicimos mucho trabajo con las proteínas paramagnéticas, pero por otra parte, al estudiar las propiedades de las barrenas, realizamos que estos métodos podrían ser interesantes, no sólo para descubrir hace señales cerca del centro paramagnético de proteínas, pero también, para observar sistemas muy grandes o para estudiar el IDPs, por ejemplo. Éste es cómo hicimos interesados en el estudio del IDPs.            

Allí en la tabla, está un espectro de la ESTAFA del synuclein alfa, que es bien sabido y caracterizado bien y ahora se ha convertido en la clase de muestra estándar para el montaje de experimentos en el IDPs. Es muy interesante porque ha implicado en la progresión de enfermedades neurodegenerative. Se ha utilizado para el revelado de los métodos en nuestro laboratorio.

Durante los 10 años pasados, al principio nosotros nos centramos en nuestro tema importante de la detección directa del carbono, pero por otra parte nos acercamos al campo del IDPs, observando todas sus propiedades peculiares, determinado la alta adaptabilidad, en gran parte las espinas dorsales expuestas disolvente y el alto dynamicity.

Quisimos saber cómo estas propiedades afectan observables del RMN y porqué, porque, si usted conoce eso, después usted puede diseñar mejores experimentos para ensanchar el alcance de usos del RMN al estudio del IDPs.

¿Cuáles eran los aspectos que encontramos importante dentro del estudio del IDPs?

Un problema bien conocido es alto recubrimiento del cruz-pico. Exploramos heteronuclei (13C y 15N) tanto cuanto sea posible, puesto que éstos son caracterizados por una dispersión más alta del movimiento químico.

Ésta era real la razón del éxito de los experimentos de la detección del carbono porque, en principal, usted puede muestrear solamente movimientos químicos heteronuclear en todas las dimensiones de los experimentos, maximizando la dispersión de los picos cruzados.

Otra propiedad peculiar es los procesos químicos muy rápidos de la cantina de los protones de la amida con el disolvente. Es mejor si usted intenta acercarse a condiciones fisiológicas tales como pH neutral y temperatura física.

A menudo, si los protones de la amida se exponen al disolvente, ensanchan fuera más allá de la detección debido a estos procesos rápidos de la cantina con el disolvente sí mismo. Una vez más en estas condiciones, el carbono descubrió experimentos se convierte en una herramienta muy valiosa para recuperar la información que, si no, generalmente acaba de ser perdida cuando estaba realizada con el protón de la amida descubrió experimentos.

Este efecto de la cantina, por otra parte, pellizcando una broca las condiciones, se puede también utilizar para acelerar la recuperación longitudinal de los protones de la amida. Por lo tanto, podemos explotar todos los trucos que se han propuesto recientemente en la literatura, para reducir la duración del RMN experimentamos; podemos reducir el tiempo que necesitamos esperar entre la ejecución de dos experimentos sucesivos. Éste es el supuesto método rápido y eso se puede también aplicar al estudio del IDPs.

Finalmente, probablemente la dimensión o el ingrediente importante de poder dirigir el estudio del IDPs cada vez más complejo, es la de usar experimentos multidimensionales con la dimensionalidad más alta de 3. Esta manera, podemos extender fuera cada vez más los cruz-picos en cada vez más dimensiones para reducir las ocasiones del recubrimiento accidental del cruz-pico.

Para esto, una variedad de aproximaciones agradables se han propuesto en la literatura. Pienso que los que estimularon realmente el uso práctico de estos experimentos eran los que dieron a utilizador una manera fácil de visualizar estos objetos altamente dimensionales.

Debo admitir que, personalmente, eran una broca asustadiza para mí; Me utilizan a tratar de 3D. Observando los espectros 3D, me tranquilizaron, pero cuando pensaba en observar 4D o 5D, era inicialmente bastante escéptico.

También fue estimulado por este proyecto del acceso bio-RMN (www.bionmr.net) ese nosotros enfocó conectado estos últimos años y también gracias a, por ejemplo, colaboraciones con Bernhard Brutscher y Wiktor Koźmiński que ahora hemos fijado una habitación completa de los experimentos del RMN que se basan en la detección del carbono o en la detección del protón. Eso ahora nos permite centrarnos en las proteínas tan complejas como 400 aminoácidos, por ejemplo.

¿Cómo puede el IDPs afectar a la incidencia de desordenes genéticos? ¿Qué papel desempeñan dentro del proteome humano y diseasome?

Comenzamos a trabajar en el IDPs observando la alfa-synuclein, que es muy interesante. Ha implicado en el inicio de enfermedades neurodegenerative pero debo admitirlo, en nuestras manos, era apenas la proteína del ANIMAL DOMÉSTICO IDP que se utilizará como muestra estándar para el montaje de los experimentos del RMN y probar y desarrollar nuevos experimentos.

Queremos utilizar todos estos experimentos para caracterizar las nuevas proteínas. Uno de los campos generales donde pueden ser aplicadas es el que comenzamos de, que es proteínas virales. Las proteínas virales tienen un genoma bastante pequeño, así que necesitan hacer buen uso de su información en términos de codificación de las funciones específicas asociadas a diversas brocas de aminoácidos.

La idea del desorden y de los pequeños adornos de la acción recíproca codificados por apenas algunos aminoácidos, ahora referidos generalmente como adelgaza (los adornos lineales cortos), es una estrategia muy atractiva para que un virus utilice una serie de aminoácido bastante compacta y codifique esta serie con una variedad de diversas funciones.

Generalmente, el desorden intrínseco es muy abundante en proteínas virales y hemos estado estudiando dos proteínas, un E7 llamado del virus de papiloma humano - un virus oncogénico - y un E1A llamado del adenovirus, una proteína homóloga a E7. Éstas son dos proteínas expresadas en las fases tempranas de la infección viral.

Es asombroso que apenas estas cadenas muy compactas del polipéptido (uno es menos de 100 aminoácidos, el otro menos de 300) pueden empeñar a una gran variedad de acciones recíprocas con las proteínas de la célula huesped.

Para citar la expresión a partir de la una los papeles de la llave en este tema, pueden “secuestrar reglas de la célula.” Éste es uno de los temas que hemos estado enfocando conectado y ahora estamos a punto de publicar los primeros resultados en este campo.

Otra área donde estos métodos pueden llegar a ser realmente útiles es el estudio de las supuestas máquinas para hacer chorizos flexibles. Nos centramos en este tema en colaboración con Peter Tompa. A menudo, cuando observamos machineries moleculares complejos, son constituidos a menudo por varios módulos se doblen que, conectados por estas máquinas para hacer chorizos flexibles.

Éste es el caso con muchos factores de la transcripción, por ejemplo. Uno de ellos, CBP, es cerca de 2.500 aminoácidos y los dominios doblados se han caracterizado a lo largo de los años, que ha explicado mucho sobre la función de la proteína.

Por otra parte, sobre la mitad de la cadena del polipéptido no se dobla, él está tan de alguna manera en un estado intrínseco desordenado. Sería muy un desecho si la naturaleza había utilizado la mitad de la serie de aminoácido para comportarse apenas como cuerdas entre las unidades dobladas.

Por lo tanto, otro proyecto que estamos enfocando conectado es la caracterización de los fragmentos intrínseco desordenados de esta proteína, para probar y para figurar si son realmente apenas cuerdas o si hay otros elementos funcionales codificados en estos pedazos flexibles de proteínas.

Sin embargo, ésta aparece ser una propiedad muy general de proteínas complejas y ésta me lleva al tema final donde pienso que el RMN puede hacer una contribución agradable. Que venimos del estudio de los pequeños fragmentos intrínseco desordenados de otro factor importante de la transcripción, el receptor del andrógeno, un tema enfocó conectado en colaboración con Javier Salvatella.

Ésta es también una proteína compleja, para la cual nos hemos centrado en los primeros 150 aminoácidos. Parece no tan interesante, apenas una pizca una proteína compleja, pero, ésta es la pieza donde hay una ocasión que las cinco glutaminas se despliegan y aumentan en gran número, cuando progresa la enfermedad.

Estas enfermedades se llaman las enfermedades del polyQ porque estos fragmentos en esta primera broca que estemos estudiando, cuando progresa la enfermedad, se caracterizan por 20, 25, 30 o 35 glutaminas en fila. Estos pedazos no cristalizan, tan allí no se sabe mucho sobre sus propiedades de alta resolución y cómo éstos se conectan al inicio de la enfermedad.

Si usted piensa en términos de usar el RMN para observar una pieza que tenga 30 Qs en fila, al principio, pensamos que nunca podríamos caracterizarla. Es una serie altamente repetidor.

En este contexto, los métodos que tienen recientemente desarrollado que foco en el IDPs lograr la alta resolución y caracterizar los sistemas flexibles, no prohibidos nos para caracterizar este primer segmento, que incluyó estas 25 glutaminas en fila. Usted puede entonces utilizar estos datos para intentar explicar las razones estos aminoácidos después causa varias enfermedades.

Un ejemplo bien conocido de una de estas enfermedades del polyQ es la enfermedad de Huntington. El origen molecular es lo mismo; un fragmento de algunos Qs que entonces se convierte más de largo y más de largo. La proteína que enfocamos prendido está el fragmento de la N-terminal del receptor del andrógeno.

El funcionamiento incorrecto causa la enfermedad llamada SBMA (atrofia muscular espinal y bulbar), que es una enfermedad rara. Ha sabido para ser relacionado con la oligomerización de estos fragmentos del polyQ. Cuanto más el Qs allí es, más estas las proteínas tienden a agregar en vez de permanecer en su estado nativo fisiológico y ésa dan lugar a la enfermedad.

Esto es, otra vez, un campo donde el RMN puede ofrecer discernimientos realmente enormes porque, por supuesto, es proteínas desordenadas y los gracias a los métodos recientemente desarrollados, uno pueden vencer las limitaciones que derivan del alto recubrimiento de estas series altamente repetidores.

Nos hemos estado centrando en este proyecto de la detección del carbono desde 2003, cuando conseguimos la primera antena con la sensibilidad perfeccionada para la detección del carbono. Comenzamos observando en este tema y, en pequeños pasos, llegamos desarrollar un equipo entero de los experimentos multidimensionales descubiertos carbono que están real en la baja de Bruker.

Esto está en colaboración con Wolfgang Bermel, Rainer Kümmerle, que ha sido parte siempre de este proyecto en personas con mi colega Roberta Pieratelli. He compartido todo el trabajo que he estado hablando con ella, así que debo darle haber también.

Mientras que movían nuestra atención cuidadosa al IDPs, también nos centramos en los métodos que no sólo fueron basados en la detección del carbono, pero intentado combinar los métodos más útiles basó en la detección del protón de la amida y también eventual, en la detección del protón de Hα que no es afectada por cantina.

Ahora, pienso que un paquete completo de experimentos multidimensionales está disponible y que se puede ejecutar fácilmente con software reciente para ofrecer realmente mucho discernimiento en el estudio del IDPs. Permite que estudiemos sistemas bastante complejos.

¿Qué el futuro espera para su investigación y la investigación en el IDPs? ¿Cómo usted utilizará el equipo de Bruker RMN en su investigación futura?

Cuando comenzamos en este tema, los sistemas más grandes caracterizados eran 100 a 150 aminoácidos de largo, mientras que, ahora, hay varios ejemplos del IDPs mientras 400 aminoácidos que muestren que esto se puede caracterizar realmente en la resolución atómica. ¿Y por eso, por qué no?

Quizá, cuando tenemos los 1,2 gigahertz, manejaremos pensar en caracterizar el IDPs tan complejo como, quizás, 1000 aminoácidos y contribuir cada vez más a este campo emocionante.

Puesto que hemos estado dedicando tanto la atención al tema de la detección del carbono, sería realmente grande ver una cierta formulación de planes de algunos progresos en 1,2 gigahertz porque el campo magnético creciente sería una ventaja obvia.

Sería muy interesante ver cómo el carbono descubrió experimentos para realizarse en campos más altos. La detección del carbono tiene una sensibilidad más inferior en cuanto a la detección del protón, pero también tiene algunas ventajas. Por ejemplo, usted no necesita suprimir la señal solvente.

No hay efectos perjudiciales grandes de la fuerza iónica más alta usada generalmente para estudiar un cierto IDPs y tan quizá, sería una manera fácil para que Bruker intente las nuevas tecnologías y vea si podemos hacer, en los 10 años próximos, otro salto de un factor de 10, que, por supuesto, muy ser apreciado.

¿Dónde pueden los programas de lectura encontrar más información?

Una reseña en mi actividad de la investigación y de la enseñanza, mi paginación de CERM

Tecnología y usos del RMN de Bruker

Sobre el Dr. Isabel FelliISABEL FELLI

Soy Isabel Felli. He estado trabajando aquí en CERM desde mi tesis del estudiante en 1993 bajo guía de profesor Ivano Bertini, mi mentor cuando comencé en el campo del RMN. Él creó en CERM un ambiente científico muy estimulante y comenzó real esta infraestructura muy grande de la investigación desde entonces la cual ahora tiene once instrumentos y ha estado ofreciendo el acceso a los utilizadores externos por todo el mundo, principal a Europa, pero por todo el mundo.

Soy muy orgulloso tener una ocasión de utilizar todos los instrumentos hermosos que están disponibles aquí en Florencia y, también, de estar implicado en una variedad de diversos proyectos que se centran en el revelado de los métodos del RMN. Toda la reacción también me estimulo que conseguimos de los utilizadores externos.

Citations

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    Bruker BioSpin - NMR, EPR and Imaging. (2020, December 17). Usando el RMN para investigar las proteínas intrínseco desordenadas: una entrevista con el Dr. Isabel Felli. News-Medical. Retrieved on October 16, 2021 from https://www.news-medical.net/news/20160630/Using-NMR-to-investigate-intrinsically-disordered-proteins-an-interview-with-Dr-Isabella-Felli.aspx.

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    Bruker BioSpin - NMR, EPR and Imaging. 2020. Usando el RMN para investigar las proteínas intrínseco desordenadas: una entrevista con el Dr. Isabel Felli. News-Medical, viewed 16 October 2021, https://www.news-medical.net/news/20160630/Using-NMR-to-investigate-intrinsically-disordered-proteins-an-interview-with-Dr-Isabella-Felli.aspx.