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Représentation de Superbe-Définition des spécimens biologiques

insights from industryDr. Manasa Gudheti
Applications Scientist
Bruker Nano Surfaces

Dans cette entrevue, les nouvelles médicales parlent à M. Manasa Gudheti des surfaces nanoes de Bruker au sujet des spécimens biologiques et comment acquérir des images de superbe-définition de elles.

Le prix 2014 Nobel en chimie menée à une augmentation notable en publications utilisant la microscopie de superbe-définition. Comment la représentation de superbe-définition est-elle différente que la photomicroscopie traditionnelle ?

Les techniques traditionnelles de photomicroscopie telles que confocal et le large-inducteur sont diffraction-limités dans la définition, qui est environ 200 nanomètre transversal (dans de x/y) et 500 à 600 nanomètre axialement (en z). Les caractéristiques qui sont plus proches que la limite de diffraction sembleront tremblées dans l'image.

les techniques de Superbe-définition surpassent ou évitent la limite de diffraction et activent de ce fait la représentation des structures dans les échantillons biologiques qui pourraient précédemment seulement être observés avec la microscopie électronique (EM). De plus, la représentation sous tension de spécimen est possible avec les techniques superbe-recherche aux définitions de sous-diffraction qui est presque impossible avec la fin de support.

Donc il y a un certain nombre de différentes méthodes puis pour réaliser la définition superbe. Est-ce que vous pouvez nous dites brièvement décrire les différences majeures entre elles, et de quel Bruker Vutara 352 emploie ?

Grand il y a trois saveurs différentes de microscopie de superbe-définition ; Microscopie structurée d'illumination (SIM), microscopie de l'épuisement d'émission stimulée (STED) et microscopie unique de localisation (SML) de molécule.

SIM peut réaliser une amélioration double de définition utilisant des configurations de Moiré et Fourier transforme. STED emploie le bureau d'études de fonctionnement d'écart de remarque pour ramener la taille de l'endroit limité par diffraction réalisant des cinq à l'amélioration de dix fois de la définition. Les techniques de SML se fondent sur localiser les positions d'un sous-ensemble de suite de molécules stochastiquement activé dans l'échantillon réalisant de ce fait les définitions jusqu'à 20 nanomètre transversal et 50 nanomètre axialement.

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Le Vutara 352 principes des utilisations SML de microscope ajoutés au dépistage de biplan pour obtenir des images en trois dimensions de superbe-définition. Par rapport à SIM et à STED, les techniques de SML offrent la meilleure amélioration de la définition avec des capacités quantitatives/analyse statistique

Quels sont les avantages d'être image capable aux régimes visuels dans la définition superbe ?

Le plus grand avantage serait la capacité de capter la dynamique dans un spécimen vivant à la définition de sous-diffraction. Dans un spécimen fixe, la représentation sera plus rapide pour cette raison réduisant le temps d'enregistrement.

Une des forces principales de la microscopie de superbe-définition est qu'elle combine les capacités en couleurs en trois dimensions de représentation de confocal avec la définition près de ceux obtenus par microscopie électronique (EM). Quoique la fin de support surpasse légèrement des techniques de superbe-définition par l'obtention près de la définition d'angström, les spécimens sous tension de représentation avec la fin de support est presque impossible.

Pouvoir à l'image au vidéo-rate avec des techniques d'unique-molécule permet à des scientifiques de capter la dynamique en temps réel des molécules biologiques en cellules vivantes. Le microscope de Vutara 352 rend la représentation de vidéo-rate possible à l'aide d'un appareil-photo ultra-rapide de sCMOS avec des algorithmes robustes et en temps réel de localisation.

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Image : Cellule de BSCI, 800 FPS, AF647 - Alphatubulin, Cy3B - TOM20

Les résultats de la représentation de superbe-définition peuvent-ils vraiment être considérés quantitatifs, plutôt que qualitatifs ?

Avec les bonnes expériences de contrôle en place on peut armer l'aspect quantitatif de la microscopie de superbe-définition d'unique-molécule. En cours de trouver les molécules uniques, les techniques de SML comptent par nature des molécules pour établir un plan des molécules localisées pour rendre l'image finale. Ceci active l'analyse statistique sur sous forme de tableaux combine fournir de ce fait des informations quantitatives en plus de l'image de superbe-définition.

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Image : Alexafluor-633 a marqué la GPI-protéine GFP-FR, protéine de membrane de plasma cette les boîtiers distincts de formes.

Où pensez-vous la représentation de superbe-définition avez-vous l'impact important, et ce qui est prochain pour cette technologie passionnante ?

Je pense que nous commençons juste à rayer la surface en termes de possibilités pour cette technologie. Récent, nous avons ajouté un balayeur confocal de lecture multipoint au microscope de Vutara 352. Ceci permet à des chercheurs d'exécuter la représentation corrélative ; c.-à-d., a recouvert une image de superbe-définition au-dessus d'une image confocale contextuelle.

L'impact important à venir sera vu dans la représentation de sous tension-cellule et de tissu. Il y a eu plusieurs défis en étendant la représentation de SML aux tissus et aux spécimens sous tension mais je pense que nous voyons le progrès considérable étant effectué dans les méthodes de préparation de bureau d'études et témoin de teinture qui le rendent possible.

Avez-vous des études de cas que vous pouvez nous dire environ ?

Les chercheurs ont utilisé le microscope de Vutara à l'image un grand choix de spécimens biologiques comprenant des cellules, des virus, des bactéries, des parties de tissu, la drosophile et le C. Elegans. Le site Web de Bruker comporte quelques exemples des applications : https://www.bruker.com/products/fluorescence-microscopes/vutara-super-resolution-microscopy/applications.html

Il y a également plusieurs publications avec des caractéristiques de superbe-définition prises sur le microscope de Vutara.

Où peuvent nos lecteurs apprendre plus au sujet de la représentation de superbe-définition ?

L'inducteur de superbe-définition évolue continuement et nous chez Bruker maintenons un oeil proche sur la littérature actuelle. Dirigez s'il vous plaît en circuit plus d'à notre page principale de publication pour apprendre plus : https://www.bruker.com/products/fluorescence-microscopes/landing-pages/super-resolution-references.html

Au sujet de M. Manasa Gudheti

M. Manasa Gudheti est un scientifique d'applications sur les surfaces nanoes de Bruker dans Salt Lake City, UT, avec au-dessus d'une décennie des compétences dans la microscopie de superbe-définition.

Manasa a gagné une licence en génie chimique l'Institut de Technologie national, Warangal, d'Inde en 1999 et un Ph.D. en génie chimique d'université de Drexel en 2004. Il a alors poursuivi un postdoctorat en biophysique dans le laboratoire de M. Sam Hess's à l'université de Maine.

En 2006, laboratoire de M. Hess le' a frayé un chemin la technique FPALM (microscopie fluorescente de microscopie de SML de localisation de photoactivation). En 2008, 3D FPALM a été développé. Cette technique de la superbe-définition 3D a été par la suite commercialisée à l'université de l'entreprise de démarrage d'Utah, Vutara. Manasa a reçu la position supérieure de scientifique chez Vutara en 2011 avec une affiliation de visite de chercheur à l'université de l'Utah.

Bruker a acquis Vutara en juillet 2014. C'était également l'année que les techniques superbe-resolved de microscopie à fluorescence ont recueilli le prix Nobel en chimie. Le produit de superbe-définition du navire amiral de Bruker, qui Manasa a été instrumental en se développant, est le microscope unique de superbe-définition de la localisation 3D (SML) de molécule de Vutara 352, basé sur une technologie brevetée de biplan.

Liste de publication de VutaraLogo de Bruker

  1. Pengpeng Li, Sean A. Merrill, Erik M. Jorgensen, Kang Shen. Deux composés de protéine d'adaptateur de Clathrin instruisent la polarité d'Axone-Dendrite. (2016) Neurone, 90(3) : 564-580. doi : 10.1016/j.neuron.2016.04.020.
  2. Lukáš Alán, Tomáš Špaček, Petr Ježek. Algorithme de Delaunay et analyse de composant principal pour la visualisation 3D des nucleoids d'ADN mitochondrial en le biplan FPALM/dSTORM. (2016) EUR Biophys J. DOI 10.1007/s00249-016-1114-5.
  3. Jonathan M. Hartley, Rui Zhang, Manasa Gudheti, Jiyuan Yang, Jindřich Kopeček. Suivant et mesurant la distribution thérapeutique de polymère à un niveau cellulaire utilisant le dSTORM 3D. (2016) J règlent le desserrage. S0168- 3659(16) 30058-X. doi : 10.1016/j.jconrel.2016.02.005.
  4. Tomáš Olejár, ‑ Reguer, Lukáš Alán, Andrea Dlasková, Petr Ježek de David Pajuelo. (2015). La totalisation accouplée de la protéine ADN-grippante à un fil mitochondriale étiquetée avec la protéine fluorescente d'EOS conçoit l'activité synchronisée des nucleoids mitochondriaux. (2015) États moléculaires de médicament, 12, 5185-5190. http://dx.doi.org/10.3892/mmr.2015.4085
  5. Hisashi Akiyama, Nora-Guadalupe Pina Ramirez, Manasa V. Gudheti, Suryaram Gummuluru. Le trafic de CD169-mediated du VIH aux invaginations de membrane de plasma en cellules dendritiques atténue l'efficacité d'anti-gp120 neutralisant grand des anticorps. (2015) PLoS Pathog. 11(3) : e1004751.
  6. Baiser de Gabriella, Jens M. Holl, Grant M. Williams, Éric Alonas, Daryll Vanover, Aaron W. Lifland, Manasa Gudheti, Ricardo C. Guerrero-Ferreira, Vinod Nair, Hong YI, prise de bec S. Graham, Philip J. Santangelo, et Elizabeth R. Wright. L'analyse de la structure du virus respiratoire syncytial indique la position de M2-1 entre la protéine de la matrice et le composé de ribonucléoprotéine. (2014) J. Virol. 88(13) : 7602-7617
  7. Rui Zhang, Jiyuan Yang, Monika Sima, Yan Zhou, Jindrich Kopeček. Thérapie combiné séquentielle de cancer ovarien avec les conjugués dégradables de paclitaxel et de gemcitabine de copolymère de methacrylamide de n (2-hydroxypropyl). (2014) Proc Acad national Sci Etats-Unis. 111(33) : 12181-12186.
  8. Éric Alonas, Aaron W. Lifland, Manasa Gudheti, Daryll Vanover, Jeenah Jung, Chiara Zurla, Jonathan Kirschman, Vincent F. Fiore, Alison Douglas, Thomas H. Barker, Hong YI, Elizabeth R. Wright, James E. Crowe, Jr., et Philip J. Santangelo. La combinaison des sondes sensibles d'ARN unique avec la représentation Subdiffraction-Limitée et de Sous tension-Cellule active la caractérisation de la dynamique de virus en cellules. (2014) Nano d'ACS. 8 (1) : 302-315.
  9. Justin G. Lichter, Éric Carruth, Chelsea Mitchell, Andreas S. Barth, Takeshi Aiba, David A. Kass, Gordon F. Tomaselli, John H. Bridge, et Frank B. Sachse. Retouche du cytosquelette sarcomeric dans les myocytes ventriculaires cardiaques pendant l'insuffisance cardiaque et après le traitement de resyncronisation cardiaque. (2014) Mole de cellules Cardiol de J. 72C : 186-195.
  10. Jeffery Hodges, patte de Xiaolin, Michael B. Landesman, John B. Ruedas, Anil Ghimire, Manasa V. Gudheti, Jacques Perrault, Erik M. Jorgensen, Jordanie M. Gerton, Saveez Saffarian. Emballage asymétrique des polymérases dans le virus de stomatite vésiculaire. (2013) Biochimie. Biophys. Recherche. Commun. 440(2) : 271-276.
  11. Nicolas Olivier, Debora Keller, Pierre Gönczy, et Suliana Manley. Définition doublant dans la représentation 3D-STORM par les tampons améliorés. (2013) Plos un. 8(7) : e69004.
  12. Brigitte Ritter, SebastiAn Murphy, Hatem Dokainish, Martine Girard, Manasa V. Gudheti, Guennadi Kozlov, Marilene Halin, Jacynthe Philie, Erik M. Jorgensen, Kalle Gehring, et Peter S. McPherson. NECAP 1 règle les interactions AP-2 pour régler la taille, le numéro, et la cargaison de vésicule pendant l'endocytose Clathrin-Assistée. (2013) PLoS Biol. 11(10) : e1001670.

Citations

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