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Imagem lactente da Super-Definição de espécimes biológicos

insights from industryDr. Manasa Gudheti
Applications Scientist
Bruker Nano Surfaces

Nesta entrevista, a notícia médica fala ao Dr. Manasa Gudheti de superfícies Nano de Bruker sobre espécimes biológicos e como adquirir imagens da super-definição delas.

O prémio nobel 2014 na química conduzida a um aumento notável nas publicações que utilizam a microscopia da super-definição. Como é a imagem lactente da super-definição diferente do que a fotomicroscopia tradicional?

As técnicas tradicionais da fotomicroscopia tais como confocal e o largo-campo são difracção-limitadas na definição, que é aproximadamente 200 nanômetro lateralmente (em xy) e 500 a 600 nanômetro axialmente (em z). As características que são mais próximas do que o limite de difracção parecerão borradas na imagem.

as técnicas da Super-definição ultrapassam ou contornam o limite de difracção e permitem desse modo a imagem lactente das estruturas nas amostras biológicas que poderiam previamente somente ser observadas com microscopia de elétron (EM). Além, a imagem lactente viva do espécime é possível com técnicas super-res em definições da secundário-difracção que é quase impossível com EM.

Tão há um número de métodos diferentes então para conseguir a definição super. Pode você momentaneamente descrever as diferenças principais entre elas, e diz-nos o Vutara 352 de que Bruker usa?

Amplamente há três sabores diferentes da microscopia da super-definição; Microscopia estruturada da iluminação (SIM), microscopia da prostração da emissão estimulada (STED) e única microscopia da localização (SML) da molécula.

SIM pode conseguir uma melhoria dupla na definição usando testes padrões de Moiré e Fourier transforma. STED usa a engenharia da função de propagação do ponto para reduzir o tamanho do ponto limitado difracção que consegue uns cinco à melhoria da dez-dobra na definição. As técnicas de SML confiam em localizar as posições de um subconjunto estocàstica ativado da série das moléculas na amostra que consegue desse modo as definições até 20 nanômetro lateralmente e 50 nanômetro axialmente.

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O Vutara 352 princípios dos usos SML do microscópio acoplados com detecção do biplano para obter imagens tridimensionais da super-definição. Em comparação com SIM e STED, as técnicas de SML oferecem a melhor melhoria na definição junto com capacidades análise quantitativa/estatística

Que são as vantagens de ser imagem capaz nas taxas video na definição super?

A vantagem a mais grande seria a capacidade para capturar a dinâmica em um espécime vivo na definição da secundário-difracção. Em um espécime fixo, a imagem lactente será mais rápida conseqüentemente reduzindo o tempo de gravação.

Uma das forças principais da microscopia da super-definição é que combina as capacidades multicoloridos tridimensionais da imagem lactente de confocal com a definição perto daqueles obtidos pela microscopia de elétron (EM). Mesmo que o EM ultrapasse ligeira técnicas da super-definição obtendo perto da definição do ångström, os espécimes vivos da imagem lactente com EM são quase impossíveis.

Poder à imagem na vídeo-taxa com técnicas da único-molécula permite cientistas de capturar a dinâmica do tempo real de moléculas biológicas em pilhas vivas. O microscópio de Vutara 352 torna a imagem lactente da vídeo-taxa possível usando uma câmera de alta velocidade do sCMOS junto com robustos, algoritmos da localização do tempo real.

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Imagem: Pilha de BSCI, 800 FPS, AF647 - Alphatubulin, Cy3B - TOM20

Podem os resultados da imagem lactente da super-definição verdadeiramente ser considerados quantitativos, um pouco do que qualitativos?

Com as experiências de controle direitas no lugar uma pode aproveitar o aspecto quantitativo da microscopia da super-definição da único-molécula. Em processo de detectar únicas moléculas, as técnicas de SML estão contando inerente moléculas para construir um mapa de moléculas localizadas para render a imagem final. Isto permite a análise estatística no tabulado coordena desse modo o fornecimento da informação quantitativa além do que a imagem da super-definição.

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Imagem: Alexafluor-633 etiquetou a GPI-proteína GFP-FR, proteína da membrana de plasma essa conjuntos distintos dos formulários.

Onde você pensa a imagem lactente da super-definição tem o impacto o mais grande, e o que é seguinte para esta tecnologia emocionante?

Eu penso que nós apenas estamos começando a riscar a superfície em termos das possibilidades para esta tecnologia. Recentemente, nós adicionamos um multi-ponto que faz a varredura do varredor confocal ao microscópio de Vutara 352. Isto permite pesquisadores de executar a imagem lactente correlativa; isto é, overlay uma imagem da super-definição sobre uma imagem confocal do contexto.

O impacto o mais grande a vir será considerado na imagem lactente da vivo-pilha e do tecido. Houve diversos desafios em estender a imagem lactente de SML aos tecidos e aos espécimes vivos mas eu penso que nós estamos vendo progressos consideráveis que estão sendo feitos nos métodos da preparação da engenharia e da amostra da tintura que os estão tornando possíveis.

Você tem algum estudo que de caso você puder nos dizer aproximadamente?

Os pesquisadores usaram o microscópio de Vutara à imagem uma variedade de espécimes biológicos que incluem pilhas, vírus, bactérias, secções do tecido, drosófila e C. Elegans. O Web site de Bruker caracteriza alguns exemplos das aplicações: https://www.bruker.com/products/fluorescence-microscopes/vutara-super-resolution-microscopy/applications.html

Há igualmente diversas publicações com os dados da super-definição tomados no microscópio de Vutara.

Onde podem nossos leitores aprender mais sobre a imagem lactente da super-definição?

O campo da super-definição está evoluindo continuamente e nós em Bruker mantemos um olho próximo na literatura actual. Dirija por favor sobre sobre a nossa página chave da publicação para aprender mais: https://www.bruker.com/products/fluorescence-microscopes/landing-pages/super-resolution-references.html

Sobre o Dr. Manasa Gudheti

O Dr. Manasa Gudheti é um cientista das aplicações em superfícies Nano de Bruker em Salt Lake City, UT, com sobre uma década da experiência na microscopia da super-definição.

Manasa ganhou um diploma de licenciado na engenharia química do Instituto de Tecnologia nacional, de Warangal, de Índia em 1999 e de um Ph.D. na engenharia química da universidade de Drexel em 2004. Levou a cabo então uma pós-graduação na biofísica no laboratório do Dr. Sam Hess na universidade de Maine.

Em 2006, o laboratório do Dr. Hess' abriu caminho a técnica FPALM da microscopia de SML (microscopia fluorescente da localização do photoactivation). Em 2008, 3D FPALM foi desenvolvido. Esta técnica da super-definição 3D foi comercializada subseqüentemente no risco startup da Universidade de Utah, Vutara. Manasa aceitou a posição superior do cientista em Vutara em 2011 junto com uma afiliação de visita do pesquisador na Universidade de Utah.

Bruker adquiriu Vutara em julho de 2014. Este era igualmente o ano que as técnicas super-resolved da microscopia de fluorescência garnered o prémio nobel na química. O produto da super-definição da capitânia de Bruker, que Manasa foi instrumental em se tornar, é microscópio da super-definição da localização 3D da molécula (SML) de Vutara 352 o único, com base em uma tecnologia patenteada do biplano.

Lista da publicação de VutaraLogotipo de Bruker

  1. Pengpeng Li, Sean A. Merrill, Erik M. Jorgensen, Kang Shen. Dois complexos da proteína do adaptador de Clathrin instruem a polaridade da Axónio-Dendrite. (2016) Neurônio, 90(3): 564-580. doi: 10.1016/j.neuron.2016.04.020.
  2. Lukáš Alán, Tomáš Špaček, Petr Ježek. Algoritmo de Delaunay e análise componente principal para o visualização 3D de nucleoids mitocondriais do ADN pelo biplano FPALM/dSTORM. (2016) EUR Biophys J. DOI 10.1007/s00249-016-1114-5.
  3. Jonathan M. Hartley, Rui Zhang, Manasa Gudheti, Jiyuan Yang, Jindřich Kopeček. Seguindo e determinando a distribuição terapêutica do polímero em um nível celular usando o dSTORM 3D. (2016) J controla a liberação. S0168- 3659(16) 30058-X. doi: 10.1016/j.jconrel.2016.02.005.
  4. Tomáš Olejár, ‑ Reguer de David Pajuelo, Lukáš Alán, Andrea Dlasková, Petr Ježek. (2015). A agregação acoplada da proteína ADN-obrigatória da único-costa mitocondrial etiquetada com a proteína fluorescente do Eos visualiza a actividade sincronizada de nucleoids mitocondriais. (2015) Relatórios moleculars da medicina, 12, 5185-5190. http://dx.doi.org/10.3892/mmr.2015.4085
  5. Hisashi Akiyama, Nora-Guadalupe Pina Ramírez, Manasa V. Gudheti, Suryaram Gummuluru. O tráfico de CD169-mediated do VIH aos invaginations da membrana de plasma em pilhas dendrítico atenua a eficácia de anti-gp120 que neutraliza amplamente anticorpos. (2015) PLoS Pathog. 11(3): e1004751.
  6. Beijo de Gabriella, Jens M. Holl, Grant M. Williams, Eric Alonas, Daryll Vanover, Aaron W. Lifland, Manasa Gudheti, Ricardo C. Guerrero-Ferreira, Vinod Nair, Hong Yi, discussão S. Graham, Philip J. Santangelo, e Elizabeth R. Wright. A análise estrutural do vírus Syncytial respiratório revela a posição de M2-1 entre a proteína da matriz e o complexo do Ribonucleoprotein. (2014) J. Virol. 88(13): 7602-7617
  7. Rui Zhang, Jiyuan Yang, Monika Sima, Yan Zhou, Jindrich Kopeček. Terapia seqüencial da combinação do cancro do ovário com os conjugado degradable do paclitaxel e do gemcitabine do copolímero do methacrylamide do n (2-hydroxypropyl). (2014) Proc Acad nacional Sci EUA. 111(33): 12181-12186.
  8. Eric Alonas, Aaron W. Lifland, Manasa Gudheti, Daryll Vanover, Jeenah Jung, Chiara Zurla, Jonathan Kirschman, Vincent F. Fiore, Alison Douglas, Thomas H. Ladrador, Hong Yi, Elizabeth R. Wright, James E. Crowe, Jr., e Philip J. Santangelo. Combinar pontas de prova sensíveis do único RNA com a imagem lactente Subdiffraction-Limitada e da Vivo-Pilha permite a caracterização da dinâmica do vírus nas pilhas. (2014) ACS Nano. 8 (1): 302-315.
  9. Justin G. Lichter, Eric Carruth, Chelsea Mitchell, Andreas S. Barth, Takeshi Aiba, David A. Kass, Gordon F. Tomaselli, John H. Ponte, e Frank B. Sachse. Remodelação do cytoskeleton sarcomeric em myocytes ventriculares cardíacos durante a parada cardíaca e após a terapia resynchronization cardíaca. (2014) Mol da pilha Cardiol de J. 72C: 186-195.
  10. Jeffery Hodges, Xiaolin Tang, Michael B. Landesman, John B. Ruedas, anil Ghimire, Manasa V. Gudheti, Jacques Perrault, Erik M. Jorgensen, Jordânia M. Gerton, Saveez Saffarian. Empacotamento assimétrico das polimerases dentro do vírus do stomatitis vesicular. (2013) Biochem. Biophys. Res. Commun. 440(2): 271-276.
  11. Nicolas Olivier, Debora Keller, Pierre Gönczy, e Suliana Manley. Definição que dobra na imagem lactente 3D-STORM através dos amortecedores melhorados. (2013) Plos um. 8(7): e69004.
  12. Brigitte Ritter, Sebastian Murphy, Hatem Dokainish, Martine Girard, Manasa V. Gudheti, Guennadi Kozlov, Marilene Halin, Jacynthe Philie, Erik M. Jorgensen, Kalle Gehring, e Peter S. McPherson. NECAP 1 regula as interacções AP-2 para controlar o tamanho, o número, e a carga da vesícula durante Endocytosis Clathrin-Negociado. (2013) Biol de PLoS. 11(10): e1001670.

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