Application de la microscopie quantitative aux cellules sous tension

insights from industryPeter BanksScientific DirectorBioTek Instruments

Dans cette entrevue, Peter Banks discute les avantages de la microscopie quantitative, et fournit le conseil sur sélecter un microscope pour cette application.

Pourquoi la microscopie a-t-elle historiquement été une technique qualitative et comment les avances dans la technologie ont-elles permis à la microscopie d'être quantitative ?

Microscopie obtenue une longue histoire. Elle a été développée il y a environ 350 ans pour que des scientifiques conçoivent des choses qu'elles pourraient discerner, mais à ne pas les décrivent. Les deux pionniers de la microscopie étaient Antoine van Leeuwenhoek, qui a développé le premier microscope et peu après le scientifique illustre, Robert Hooke.

Leurs microscopes ont magnifié des spécimens par 10-20 fois qui leur ont permises de concevoir des coordonnées des spécimens connus comme des poux étroitement pour la première fois, mais la découverte remarquable était un monde microscopique qu'elles n'ont pas connu étaient là.

Bactéries microscopiques

Van Leeuwenhoek a inventé les animalcules de condition, qui représente ce que nous appellerions des bactéries et d'autres protozoaires dans l'eau au sujet de la laquelle la science n'a connu rien. Avec ces microscopes tôt, ils pouvaient les concevoir pour la première fois.

Au-dessus du reste de l'histoire de 350 ans de la microscopie, c'a été une technique qualitative. Les chercheurs et les scientifiques ont voulu concevoir les spécimens microscopiques et enregistrer ce qu'ils voient.

La microscopie quantitative est bien un morceau différent. Elle a été activée par l'ère numérique, et particulièrement par la capacité de numériser la lumière par l'utilisation des transducteurs comme les dispositifs accouplés chargés, ou les caméras ccd, qui sont présentes dans presque chaque appareil photo numérique de nos jours.

Ces appareils-photo permettent la capture d'images dans un format numérique qui peut alors être traité et s'analysé utilisant des programmes informatiques pour mesurer la biologie dans votre image.

Comment la microscopie quantitative peut-elle être employée pour évaluer les environnements intracellulaires ?

Il y a une foule de voies de faire la microscopie quantitative. Une voie très courante de faire une expérience quantitative par microscopie emploie les sondes fluorescentes variées. Type ceci commence par l'utilisation d'une souillure nucléaire. Ce sont les souillures chimiques avec une sélectivité pour l'ADN.

Presque tout l'ADN de vos cellules est situé au noyau, ainsi cette souillure chimique souillera préférentiellement le noyau, permettant aux noyaux dans votre image d'être recensés. Avec la supposition qu'une cellule a un noyau, cette première souillure permet à des cellules dans votre image d'être recensées et comptées.

Alors d'autres sondes fluorescentes de différentes couleurs peuvent être employées pour regarder l'un ou l'autre de structures cellulaires et/ou pour mesurer la fonction cellulaire. Il y a une grande variété de sondes fluorescentes disponibles dans le commerce. Comme exemples, nous pouvons employer différentes sondes fluorescentes pour mesurer le potentiel de membrane mitochondrial, la production des espèces réactives de l'oxygène, ou des événements de translocation de protéine.

Cette dernière application emploie caspase-3, qui est activé par l'apoptose pour transférer du cytoplasme au noyau. Nous avons également employé la microscopie pour mesurer la transcription de biomarqueur de cancer d'ARN par l'utilisation de l'hybridation in-situ fluorescente. Il y a tant de possibilités pour la microscopie quantitative parce qu'il y a une myriade de différentes sondes procurables.

Quels avantages la microscopie quantitative permet-elle au-dessus des microscopes traditionnels ?

La microscopie quantitative active la biologie cellulaire en fournissant la mesure quantitative directe et en temps réel des procédés de cellules par à traitement d'images et l'analyse.

Si on considère un microscope traditionnel étant un dispositif avec seulement des capacités qualitatives (pas à traitement d'images ou analyse), alors les images remarquables peuvent être structure cellulaire détaillante acquise, mais la mesure de fonction cellulaire est au mieux semi-quantitative. L'imagerie numérique et la puissance des ordinateurs combinent pour fournir la microscopie quantitative.

Un exemple de l'installation de la microscopie quantitative est dans la découverte de médicaments utilisant un modèle cellulaire exprimant un phénotype qui simule une maladie particulière. Ce phénotype a pu être aussi simple que la capacité d'une lignée cellulaire de cancer de proliférer.

Les traitements efficaces réduiraient ou arrêteraient la prolifération de ces cellules. Ce phénotype peut être mesuré en comptant les cellules en temps réel utilisant la microscopie.

Ceci fournira les informations au sujet dont les médicaments sont en activité contre le phénotype, classent leur capacité de supprimer le phénotype, déterminent la cinétique des drogues psycho-actives et mesurent la pharmacologie des médicaments les plus prometteurs.

Sondes fluorescentes

Les balises fluorescentes ou les teintures sont-elles une nécessité pour la microscopie quantitative ?

Les sondes fluorescentes sont très utiles pour la microscopie quantitative et on ont été développés pour fixe et vivent des analyses de cellules. des méthodes marque Marque peuvent également être employées pour la microscopie quantitative et c'est particulièrement avantageuse pour la représentation sous tension de cellules.

BioTek a un certain nombre de méthodes pour effectuer la microscopie quantitative marque marque, sans utilisation des sondes fluorescentes. La glissière de brightfield, qui surveille la capacité d'un spécimen d'absorber la lumière blanche est une forme de microscopie marque marque. Nous avons employé cette forme de microscopie pour mesurer les % de confluent des cellules dans un microplate bon et dans des analyses d'envahissement tumoral.

BioTek a également une méthode de propriété industrielle pour améliorer le contraste de notre glissière de brightfield qui permet le comptage de cellules marque marque pour des applications comme la prolifération cellulaire, par exemple. De plus, certains de nos instruments possèdent une glissière de contraste de phase de la microscopie, qui utilise la réfraction de la lumière par l'échantillon pour l'amélioration de contraste. Ceci a été employé pour mesurer l'apoptose en mesurant l'arrondi des cellules.

Quels microscopes font alimentation de BioTek pour la microscopie quantitative ?

Les microscopes de BioTek fournissent la microscopie digitale robotisée de widefield. Par robotisé, je veux dire que la capture d'images, le traitement et l'analyse peuvent tout être exécutés par l'instrument avec des paramètres de préréglage entrés par le conducteur.

Nos microscopes concernent un type de géométrie, qui emploie inversé, modèle epifluorescent. Les modes de la microscopie procurables comprennent la fluorescence, le brightfield, le brightfield contrasté, le brightfield de couleur et le contraste de phase.

Comment le FX de Cytation 3, de Cytation 5 et de Lionheart diffèrent-ils ? Pour quel type de chercheur chaque microscope est-il conçu ?

Le développement de ces instruments a été initialement basé sur notre connaissance de nos marchés alors. Nous avons été une compagnie d'instrumentation de microplate pendant plus de 30 années ainsi le premier produit que nous avons eu dans la microscopie a été basé sur le modèle d'un de nos lecteurs de microplate plus populaires dans lesquels nous avons ajouté inversé, microscope conçu par epifluorescence.

Ainsi nos propriétaires pourraient exécuter toutes leurs applications typiques de lecteur de microplate, comme des ELISA, protéine, ADN et analyses de gène de journaliste, mais font maintenant également la microscopie de widefield de brightfield et de fluorescence. Ce premier produit était le Cytation 3 qui a été lancé en avril 2013.

Au cours des trois années à venir, nous avons augmenté le numéro des modes de microscopie procurables pour inclure le brightfield contrasté et dans le Cytation 5, le brightfield de couleur et le contraste de phase.

Au-dessus de cette période, de nous également sensiblement améliorés nos capacités dans la microscopie quantitative en développant continuement les outils neufs à traitement d'images et d'analyse.

Le FX de Lionheart est notre plus nouveau produit et quelque peu différent des produits de Cytation dans cela il n'y a aucun bloc optique traditionnel de lecteur de microplate dans l'instrument, il a été conçu pour le microscopiste qui veut faire la représentation sous tension de cellules.

La représentation fixe de cellules peut encore être exécutée, mais tous les aspects environnemental et d'humidité de contrôle de cet instrument ont été conçus pour activer des expériences cinétiques à long terme utilisant la microscopie. En outre, la microscopie à haute résolution exquise peut être effectuée sur Lionheart avec des objectifs à immersion dans l'huile du microscope 60x et 100x.

FX de Lionheart

Support sous tension cinétique d'analyse de cellules de FX de Lionheart. Le panneau de contrôle de l'environnement contient la température et le gaz. La chambre d'humidité supporte la cinétique sous tension de cellules de long terme. Les doubles injecteurs de réactif fournissent vite injectent/images pour observer des réactions rapides

Peut tout de vos microscopes quantitatifs être employé pour la représentation sous tension de cellules ? Ou juste le FX de Lionheart ?

Chacun des trois peut être employé pour la représentation sous tension de cellules. Le Cytation 3 et 5 ont un Contrôleur annexe de gaz qui met à jour la Co2 et les niveaux2 d'O directement dans la chambre de dépistage de l'instrument, qui est également à température contrôlée.

C'est utile pour des expériences cinétiques de plus court terme utilisant les cellules sous tension. Il n'y a aucun contrôle d'humidité dans le Cytation 3 ou Cytation 5 ainsi pour des expériences cinétiques à long terme nous recommandons l'utilisation de notre incubateur automatisé de BioSpa 82 Co qui retient au moins huit (8) pièces de labware.

Le BioSpa fournit les microplates ou tout autre labware au Cytation 3 ou 5 et les renvoie à l'incubateur une fois qu'un relevé est fait par l'intermédiaire d'une arme robotisée.

De plus, le BioSpa 8 également surveille les conditions environnementales et enregistre les caractéristiques. Ce mariage des instruments fait partie de notre système de BioSpa pour des analyses cinétiques à long terme avec les cellules sous tension.

Le FX de Lionheart est un instrument indépendant qui règle la température, la Co2 et les niveaux2 d'O, et humidité directement. Le Lionheart est plus pour le microscopiste traditionnel qui veut tout au plus faire une plaque à la fois.

Quel type d'événements cellulaires peut être observé de cette façon ?

Des événements cellulaires en temps réel en cellules sous tension peuvent être triés par la longueur des expériences cinétiques étant conduites. Les expériences cinétiques à long terme vérifient des cellules pendant des jours à une semaine ou à deux. Par exemple les études de prolifération cellulaire utilisées dans la recherche en matière d'oncologie, exigent type jusqu'à une semaine de compléter.

Les variations sur la prolifération cellulaire seraient recherche de cytotoxicité, où des médicaments sont ajoutés pour essayer et empêcher la prolifération cellulaire. Les analyses d'éraflure ou de cicatrisation sont également des applications courantes. Ces études peuvent durer de autour d'un jour à plusieurs jours selon les capacités de transfert des cellules particulières que vous êtes intéressé dedans.

Les analyses d'envahissement tumoral peuvent également avoir besoin de plusieurs jours pour compléter. Dans ces analyses, cellules totalisées dans un sphéroïde et entourées par l'imitateur de matrigel l'état in vivo d'une tumeur en tissu environnant. Le régime que les cellules de sphéroïde envahissent dans un support biologique environnant est mesuré.

Réciproquement, les expériences cinétiques de cellules sous tension à court terme durent des minutes plutôt que des jours. Ces analyses vérifient la fonction cellulaire rapide. Par exemple, la représentation de calcium mesure le flux en temps réel de l'ion calcium induit par l'activation des récepteurs.

Ce flux monte et des chutes type pendant environ une minute. Avec la représentation, nous pouvons déterminer comment les différentes cellules répondent différemment à l'activation des récepteurs. C'est évident dans l'importance et la cinétique de la production2+ de Ca.

Nous avons également mesuré la cinétique des deuxièmes messagers dans GPCR signalant, une famille de gènes hautement druggable. GPCRs représentent environ 60% de tous les médicaments connus, les effectuant fortement étudiés par des sociétés pharmaceutiques. Ces deuxièmes messagers ont également une cinétique rapide qui sont type dépensées dans la gamme minutieuse.

Ces analyses utilisées génétiquement ont codé la technologie fluorescente de protéine qui ou ont augmenté ou la fluorescence diminuée ont basée sur la présence de ces deuxièmes messagers. Ceci te permet également de multiplexer le dépistage de ces deuxièmes messagers : par exemple, nous avons multiplexé un camp avec un biocapteur de diacylglycerol. C'est une application biologique quantitative réellement gentille.

Ainsi avec tous nos instruments, nous pouvons faire le court terme et les expériences cinétiques à long terme sur les cellules sous tension.

Fournissez-vous le logiciel à traitement d'images qui peut être employé avec vos microscopes ?

Je veux commencer par effectuer une différence entre le traitement de représentation et l'analyse de représentation. À mon avis, le traitement de représentation concerne la réduction, le lissage, piquer un montage des images ensemble ou la prise de mouvement propre d'une Z-pile et d'une projection par la biologie épaisse.

Réciproquement, l'analyse d'image emploie des algorithmes variés pour mesurer la biologie après avoir acquis et traité cette image. Nous avons deux niveaux différents de logiciel d'analyse d'image pour répondre à des besoins spécifiques d'analyse.

Gen5 Image+ te permet d'exécuter des applications plus simples comme compter des cellules, mesurant le rendement de transfection du GFP, par exemple ou déterminant % de confluent.

Gen5 Image+

La perfection de l'image Gen5, contient un envoi beaucoup plus sophistiqué des outils d'analyse d'image qui active réellement des applications quantitatives dans la microscopie. Ces applications comprennent la translocation nucléaire, l'hybridation in-situ fluorescente, les études de Co-localisation, et l'analyse de cycle cellulaire, notamment.

Perfection de l

Où voyez-vous le sens de la microscopie quantitative déménager à l'avenir ? En termes d'amélioration en logiciel de représentation et dans l'automatisation de microscopie ?

Je pense que BioTek est maintenant déterminé en tant que chef dans la microscopie quantitative robotisée. Nous continuerons à promouvoir cette réputation pendant que nous établissons à l'extérieur nos capacités en simplifiant la microscopie par l'automatisation et en renforçant le potentiel phénotypique d'analyse que la perfection d'image active.

Un endroit où je pense que la microscopie quantitative robotisée peut être extrêmement avantageuse est appliqué aux méthodes de la culture cellulaire 3D. Les scientifiques éloignent de la représentation par couche des 2D cellules plaquées, si sur un puits de guide ou de microplate de microscope.

La recherche considérable est exécutée avec des structures comme des hydrogels, des sphéroïdes, des tissus et l'organe sur des dispositifs de frite. Je pense que la microscopie quantitative robotisée peut mieux activer ces types physiologique appropriés d'analyses, où l'échantillon d'expérience ressemble plus attentivement que se passe-t-il dans les êtres humains.

Où peuvent nos lecteurs découvrir plus au sujet de BioTek et de vos microscopes quantitatifs ?

https://www.cellimager.com/

https://www.biotek.com/

Au sujet de Peter Banks

Peter Banks

Peter Banks est le directeur scientifique chez BioTek Instruments, Inc. que ses responsabilités comprennent le management des applications de la compagnie team et fournissant le guidage scientifique à l'équipe de seniors management sur la technologie neuve et les tendances émergentes influençant le marché de microplate et à ses marchés périphériques de traiter et de dépistage de liquide.

Avant de joindre BioTek en 2008, des côtés ont été utilisés dans un certain nombre de rôles dans PerkinElmer pendant une décennie. Ces rôles ont compris le management du programme de R&D de BioPharma de PerkinElmer et le directeur de la pharmacologie moléculaire pour le biosignal de PerkinElmer à Montréal, Canada, se concentrant sur le développement de nombreux technologies de dépistage et systèmes de réactif pour l'examen critique élevé de débit.

Avant des expériences chez PerkinElmer et BioTek, les côtés étaient un professeur adjoint en chimie analytique à l'université de Concordia, Montréal, Canada à partir de 1994 à 1998. Des côtés ont été attribués une camaraderie post-doctorale de NSERC en 1993 après sa dissertation pour le PhD à l'université de la Colombie-Britannique en 1992.

Citations

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