Applicando microscopia quantitativa alle celle in tensione

insights from industryPeter BanksScientific DirectorBioTek Instruments

In questa intervista, Peter Banks discute i vantaggi di microscopia quantitativa e formula il consiglio sul selezionare un microscopio per questa applicazione.

Perché la microscopia è stata storicamente una tecnica qualitativa e come gli avanzamenti nella tecnologia hanno permesso alla microscopia di essere quantitativa?

Microscopia ottenuta una lunga storia. È stata sviluppata circa 350 anni fa affinchè gli scienziati prevedi le cose che potrebbero discernere, ma da non descrivere. I due pionieri di microscopia erano Antoine van Leeuwenhoek, che ha sviluppato il primo microscopio e presto dopo lo scienziato rinomato, Robert Hooke.

I loro microscopi hanno ingrandetto gli esemplari entro 10-20 volte che li hanno permessi di prevedere i dettagli degli esemplari conosciuti come i pidocchi su vicino per la prima volta, ma la scoperta notevole era un mondo microscopico che non hanno conosciuto erano là.

Batteri microscopici

Van Leeuwenhoek ha punzonato gli microbi di termine, che rappresenta che cosa avremmo chiamato i batteri ed altri protozoi in acqua cui la scienza non ha conosciuto niente circa. Con questi microscopi in anticipo, potevano visualizzarli per la prima volta.

Sopra il bilanciamento della cronologia di 350 anni di microscopia, è stato una tecnica qualitativa. I ricercatori e gli scienziati hanno voluto prevedere gli esemplari microscopici e riferire che cosa vedono.

La microscopia quantitativa è abbastanza un bit differente. È stata permessa a dall'era digitale e specificamente dalla capacità di digitalizzare l'indicatore luminoso con l'uso dei trasduttori come le unità coppia fatte pagare, o le telecamere CCD, che sono presenti in quasi ogni macchina fotografica digitale attualmente.

Queste macchine fotografiche permettono l'acquisizione immagine in un formato digitale che può poi essere elaborato ed analizzato facendo uso dei programmi informatici per quantificare la biologia nella vostra immagine.

Come può la microscopia quantitativa essere usata per valutare gli ambienti intracellulari?

C'è una miriade di modi fare la microscopia quantitativa. Un modo molto comune di fare un esperimento quantitativo con microscopia sta usando le varie sonde fluorescenti. Questo comincia tipicamente con l'uso di una macchia nucleare. Queste sono macchie chimiche con una selettività per DNA.

Quasi tutto il DNA delle vostre cellule è situato nel nucleo, in modo da questa macchia chimica macchierà preferenziale il nucleo, permettendo che i nuclei nella vostra immagine siano identificati. Con il presupposto che una cella ha un nucleo, questa prima macchia permette che le celle nella vostra immagine siano identificate e contate.

Poi altre sonde fluorescenti dei colori differenti possono essere usate per esaminare o le strutture della cellula e/o per quantificare la funzione cellulare. C'è un'ampia varietà di sonde fluorescenti disponibili nel commercio. Come esempi, possiamo usare le sonde fluorescenti differenti per quantificare il potenziale di membrana mitocondriale, la produzione delle specie reattive dell'ossigeno, o gli eventi dello spostamento della proteina.

Questa applicazione posteriore usa caspase-3, che è attivato dal apoptosis per spostare dal citoplasma al nucleo. Egualmente abbiamo usato la microscopia per quantificare la trascrizione di biomarcatore del cancro del RNA con l'uso dell'ibridazione in situ fluorescente. Ci sono tante possibilità per microscopia quantitativa perché c'è una miriade delle sonde differenti disponibili.

Che vantaggi la microscopia quantitativa permette sopra i microscopi tradizionali?

La microscopia quantitativa permette alla biologia cellulare fornendo la misura quantitativa diretta e in tempo reale dei trattamenti delle cellule con sia trattamento che l'analisi di immagine.

Se si considera un microscopio tradizionale che è un'unità con soltanto le capacità qualitative (nessun trattamento o analisi di immagine), quindi le immagini notevoli possono acquistarsi dettagliando la struttura cellulare, ma la misura cellulare di funzione è nel migliore dei casi semiquantitativa. La rappresentazione di Digital e la potenza del computer si combinano per fornire la microscopia quantitativa.

Un esempio dell'utilità di microscopia quantitativa è nella scoperta della droga facendo uso di un modello cellulare che esprime un fenotipo che simula una malattia particolare. Questo fenotipo ha potuto essere semplice quanto la capacità di una linea cellulare del cancro di proliferare.

Le efficaci droghe diminuirebbero o fermerebbero la proliferazione di queste celle. Questo fenotipo può essere quantificato contando le celle in tempo reale facendo uso di microscopia.

Ciò fornirà informazioni riguardo a cui le droghe sono attive contro il fenotipo, allineano la loro capacità di sopprimere il fenotipo, determinano la cinetica delle droghe attive e quantificano la farmacologia delle droghe di promessa.

Sonde fluorescenti

Sono i tag o le tinture fluorescenti una necessità per microscopia quantitativa?

Le sonde fluorescenti sono molto utili per microscopia quantitativa e molti sono stati sviluppati per sia fissato che vivono analisi delle cellule. i metodi contrassegni Contrassegno possono anche essere usati per microscopia quantitativa e questo è particolarmente utile per la rappresentazione in tensione delle cellule.

BioTek ha una serie di metodi per l'esecuzione della microscopia quantitativa contrassegna contrassegno, senza l'uso delle sonde fluorescenti. Il canale del brightfield, che riflette la capacità di un esemplare di assorbire la luce bianca è un modulo di microscopia contrassegna contrassegno. Abbiamo usato questo modulo di microscopia per misurare i % della confluenza delle celle in un microplate buono e nelle analisi di invasione del tumore.

BioTek egualmente ha un metodo privato per il miglioramento del contrasto del nostro canale del brightfield che permette il contaggio di cellule contrassegno contrassegno per le applicazioni come proliferazione delle cellule, per esempio. Inoltre, alcuni dei nostri strumenti possiedono un canale di contrasto di fase di microscopia, che utilizza la rifrazione di indicatore luminoso attraverso il campione per il potenziamento di contrasto. Ciò è stata usata per il apoptosis di misura through misurando la rotondità delle celle.

Che microscopi fanno offerta di BioTek per microscopia quantitativa?

I microscopi di BioTek forniscono la microscopia digitale automatizzata del widefield. Dall'automatizzato da, significo che l'acquisizione immagine, il trattamento e l'analisi possono tutti essere eseguiti dallo strumento con i parametri di preregolamento introdotti dall'operatore.

I nostri microscopi comprendono un tipo di geometria, che usa invertita, progettazione epifluorescent. I modi di microscopia disponibili comprendono la fluorescenza, il brightfield, il brightfield ad alto contrasto, il brightfield di colore ed il contrasto di fase.

Come Cytation 3, Cytation 5 e Lionheart FX differiscono? Che tipo di ricercatore ogni microscopio è progettato per?

Lo sviluppo di questi strumenti originalmente è stato basato allora sulla nostra conoscenza dei nostri servizi. Siamo stati una società di strumentazione del microplate per oltre 30 anni in modo dal primo prodotto che abbiamo avuti nella microscopia è stato basato sulla progettazione di uno dei nostri lettori del microplate più popolari in cui abbiamo aggiunto invertita, microscopio progettato epifluorescence.

Così i nostri clienti potrebbero eseguire tutte le loro applicazioni tipiche del lettore del microplate, come ELISAs, proteina, analisi del gene del reporter e del DNA, ma ora egualmente fanno la microscopia del widefield della fluorescenza e del brightfield. Questo primo prodotto era il Cytation 3 che è stato lanciato nell'aprile 2013.

Nel corso dei tre anni successivi, abbiamo ampliato il numero dei modi di microscopia disponibili per comprendere il brightfield ad alto contrasto e nel Cytation 5, nel brightfield di colore e nel contrasto di fase.

Per questo periodo, egualmente abbiamo migliorato significativamente le nostre abilità nella microscopia quantitativa continuamente sviluppando i nuovi strumenti di trattamento e di analisi di immagine.

Lionheart FX è il nostro più nuovo prodotto ed in qualche modo differente dai prodotti di Cytation in quanto non ci sono le ottica tradizionali del lettore del microplate nello strumento, sono stati progettati per il microscopista che vuole fare la rappresentazione in tensione delle cellule.

La rappresentazione fissa delle cellule può ancora essere eseguita, ma tutti gli aspetti di umidità ed ambientale di controllo di quello strumento sono stati destinati per permettere agli esperimenti cinetici a lungo termine facendo uso di microscopia. Ancora, la microscopia ad alta definizione squisita può essere eseguita su Lionheart con sia obiettivi d'immersione in olio del microscopio 60x che 100x.

Lionheart FX

Supporto in tensione cinetico di analisi delle cellule di Lionheart FX. Il coperchio di controllo dell'ambiente contiene la temperatura ed il gas. La camera di umidità supporta la cinetica in tensione delle cellule di lungo termine. Gli iniettori doppi del reagente forniscono rapidamente iniettano/immagine per osservare le reazioni veloci

Possono tutti i vostri microscopi quantitativi essere utilizzati per la rappresentazione in tensione delle cellule? O appena il Lionheart FX?

Tutti e tre le possono essere usati per la rappresentazione in tensione delle cellule. I Cytation 3 e 5 hanno un regolatore accessorio del gas che mantiene il CO2 ed i livelli2 di O direttamente nella camera di rilevazione dello strumento, che è egualmente a temperatura controllata.

Ciò è utile per gli esperimenti cinetici di più breve termine facendo uso delle celle in tensione. Non c'è controllo di umidità nel Cytation 3 o in Cytation 5 in modo da per gli esperimenti cinetici a lungo termine raccomandiamo l'uso della nostra incubatrice automatizzata di BioSpa 82 CO che tiene almeno otto (8) pezzi di labware.

Il BioSpa consegna i microplates o l'altro labware ai Cytation 3 o 5 e li restituisce all'incubatrice una volta che una lettura è fatta tramite braccio robot.

Inoltre, il BioSpa 8 egualmente riflette le condizioni ambientali e registra i dati. Questo matrimonio degli strumenti fa parte del nostro sistema di BioSpa per le analisi cinetiche a lungo termine con le celle in tensione.

Il Lionheart FX è uno strumento autonomo che gestisce la temperatura, il CO2 ed i livelli2 di O ed umidità direttamente. Il Lionheart è più per il microscopista tradizionale che al massimo vuole fare una lastra grossa per volta.

Che tipo di eventi cellulari possono essere osservati in questo modo?

Gli eventi cellulari in tempo reale in celle in tensione possono essere ordinati dalla lunghezza degli esperimenti cinetici che sono condotti. Gli esperimenti cinetici a lungo termine studiano le celle durante i giorni ad una settimana o a due. Per esempio gli studi di proliferazione delle cellule utilizzati nella ricerca nell'oncologia, richiedono tipicamente fino ad una settimana per completare.

Le variazioni su proliferazione delle cellule sarebbero la ricerca di citotossicità, dove le droghe si aggiungono per provare ed inibire la proliferazione delle cellule. Le analisi curative della ferita o del graffio sono egualmente le applicazioni comuni. Questi studi possono durare a partire intorno ad un giorno a parecchi giorni secondo le capacità di migrazione delle celle che particolari siete interessato dentro.

Le analisi di invasione del tumore anche possono richiedere parecchi giorni per completare. In queste analisi, celle cumulate in una sferoide e circondate dal mimo del matrigel lo stato in vivo di un tumore in tessuto circostante. La tariffa che le celle della sferoide invadono in un media biologico circostante è quantificata.

Per contro, gli esperimenti cinetici delle cellule in tensione a breve termine durano i minuti piuttosto che i giorni. Queste analisi studiano la funzione cellulare rapida. Per esempio, la rappresentazione del calcio misura il cambiamento continuo in tempo reale dello ione del calcio indotto dall'attivazione del ricevitore.

Questo cambiamento continuo aumenta tipicamente e cadute durante circa un minuto. Con la rappresentazione, possiamo determinare come le diverse celle rispondono diversamente all'attivazione del ricevitore. Ciò è evidente sia nella grandezza che nella cinetica di produzione2+ di Ca.

Egualmente abbiamo misurato la cinetica dei secondi messaggeri in GPCR che segnala, una famiglia altamente druggable del gene. GPCRs rappresenta intorno 60% di tutte le droghe conosciute, facendole altamente studiate dalle ditte farmaceutiche. Questi secondi messaggeri egualmente hanno cinetica veloce che è spesa tipicamente nell'intervallo minuscolo.

Queste analisi usate geneticamente hanno codificato la tecnologia fluorescente della proteina che o sono aumentato o la fluorescenza in diminuzione ha basato sulla presenza di questi secondi messaggeri. Ciò egualmente permette che multiplexiate la rilevazione di questi secondi messaggeri: per esempio, abbiamo multiplexato un campo con un biosensore di diacylglycerol. Quella è un'applicazione biologica quantitativa realmente piacevole.

Così con tutti gli nostri strumenti, possiamo fare sia gli esperimenti cinetici a breve termine che a lungo termine sulle celle in tensione.

Fornite il software di trattamento di immagine che può essere usato con i vostri microscopi?

Voglio cominciare facendo una differenza fra trattamento della rappresentazione e l'analisi della rappresentazione. Alla mia mente, il trattamento della rappresentazione comprende la riduzione, il lisciamento, la cucitura del montaggio delle immagini insieme o la cattura di sfondo una Z-pila e della proiezione con la biologia spessa.

Per contro, l'analisi sulla base di immagini usa i vari algoritmi per quantificare la biologia dopo l'acquisto ed elaborato della quell'immagine. Abbiamo due livelli differenti di software di analisi sulla base di immagini per soddisfare le richieste specifiche dell'analisi.

Gen5 Image+ permette che eseguiate le applicazioni più semplici come il conteggio delle celle, misuranti il risparmio di temi di transfezione di GFP, per esempio o determinanti % della confluenza.

Gen5 Image+

La perfezione di immagine Gen5, contiene un pacchetto molto più specializzato degli strumenti di analisi sulla base di immagini che realmente permette alle applicazioni quantitative nella microscopia. Queste applicazioni comprendono lo spostamento nucleare, l'ibridazione in situ fluorescente, gli studi della co-localizzazione e l'analisi del ciclo cellulare, tra l'altro.

Perfezione di immagine Gen5

Dove vedete la direzione di microscopia quantitativa muoverti in futuro? Sia in termini di miglioramento nel software di rappresentazione che nell'automazione di microscopia?

Penso che BioTek ora sia stabilito come guida nella microscopia quantitativa automatizzata. Continueremo ad avanzare questa reputazione mentre sviluppiamo fuori le nostre capacità nella facilitazione della microscopia con automazione e nell'aumento delle capacità fenotipiche di analisi a che la perfezione di immagine permette.

Un'area dove penso che la microscopia quantitativa automatizzata possa essere estremamente utile si applica ai metodi della coltura cellulare 3D. Gli scienziati stanno muovendo a partire dalla rappresentazione un il livello di 2D celle placcate, se su un pozzo della diapositiva o del microplate del microscopio.

L'estesa ricerca sta realizzanda con le strutture come gli idrogel, le sferoidi, i tessuti e l'organo sulle unità del chip. Penso che la microscopia quantitativa automatizzata possa permettere meglio a questi tipi fisiologicamente pertinenti di analisi, dove il campione di esperimento somiglia più molto attentamente a che cosa sta continuando in esseri umani.

Dove possono i nostri lettori scoprire più circa BioTek ed i vostri microscopi quantitativi?

https://www.cellimager.com/

https://www.biotek.com/

Circa Peter Banks

Peter Banks

Peter Banks è il Direttore scientifico a BioTek Instruments, Inc. Le sue responsabilità comprendono la gestione delle applicazioni della società team e fornendo l'orientamento scientifico al gruppo di amministrazione superiore sulla nuova tecnologia e sulle tendenze emergenti che urtano il servizio del microplate ed ai sui servizi periferici di manipolazione e di rilevazione del liquido.

Prima dell'aggiunta del BioTek nel 2008, i gruppi illuminazione diffusa sono stati impiegati in una serie di ruoli all'interno di PerkinElmer per una decade. Questi ruoli hanno incluso la gestione del programma di R & S del BioPharma di PerkinElmer e Direttore di farmacologia molecolare per il biosegnale di PerkinElmer a Montreal, Canada, mettente a fuoco sullo sviluppo di numerosi tecnologie di rilevazione e sistemi del reagente per l'alta selezione di capacità di lavorazione.

Prima delle esperienze a PerkinElmer e a BioTek, i gruppi illuminazione diffusa erano un assistente universitario in chimica analitica alla Concordia University, Montreal, Canada dal 1994 al 1998. I gruppi illuminazione diffusa hanno ricevuto un'amicizia post-dottorato di NSERC nel 1993 dopo la sua dissertazione per il PhD all'università di British Columbia nel 1992.

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    BioTek. (2019, April 11). Applicando microscopia quantitativa alle celle in tensione. News-Medical. Retrieved on April 10, 2020 from https://www.news-medical.net/news/20161202/Applying-quantitative-microscopy-to-live-cells.aspx.

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